金石清瘟解毒口服液对流感病毒B型与腺病毒的体外抑制作用

张碧海 江柏华 蒋鹏娜 谭莉君

（黑龙江省中医药科学院·150036）

呼吸道感染有正粘病毒科中的流感病毒甲、乙、丙型，副粘病毒科中的呼吸道合胞病毒、副流感病毒等以及其它的腺病毒等，分别为单负股RNA病毒和双股DNA无包膜病毒，均能引起上下呼吸道等多种疾病[1]。对病毒性感冒尚无有效的治疗措施，本研究利用我院的院内制剂金石清瘟解毒口服液，选用流感病毒B型和腺病毒(AdV3)分别在MDCK细胞系和HeLa细胞系上进行体外病毒抑制作用的研究，测定该药物的抗病毒谱，以及50%药效剂量(IC50)治疗指数(TI值)，现报道结果如下：

1 材料

1.1 试验药物

将金石清瘟解毒口服液50ml溶解于100ml无菌双蒸水中，除菌过滤，无菌试验72h -4℃保存待测。西药对照：利巴韦林注射液(沪卫药准字(1995)第0071070号，中国信谊药厂)，规格1ml装(100 mg)。

1.2 病毒

甲型流感病毒为本室冻干毒种，接种在8-12天龄鸡胚尿囊腔上传代，72 h后取尿囊液其血凝效价是1：1280,再将尿囊液在MDCK细胞滴定50%组织细胞感染剂量(TCID50)为10-5.4，AdV3来源于黑龙江省疾病控制中心病毒研究所，在HeLa细胞传代后滴定TCID50为10-6.5，两毒种分装后贮存-84℃备用

1.3 细胞

MDCK细胞传代株及HeLa细胞传代株为黑龙江省疾病控制中心病毒研究所冻存备用。

1.4 主要设备

倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)，CO2无恒温培养箱(日本大和科学株式会社)，-85℃超低温冰箱(日本三洋公司)，96孔细胞培养板(美国BD公司)等。

2 方法

2.1 药物对MDCK和HeLa细胞毒性测定

将上述制备药液，用无血清的DMEM液10倍系列稀释后接种于已形成单层的MDCK和HeLa细胞孔中，每孔100μl，每一个稀释度重复4孔，以DMEM液作正常细胞对照,37℃ 5%CO2培养箱培养，每日观察CPE，以“+—++++”记录结果，按Reed-Muench法[2]计算药物的半数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD0)[3]。西药对照药利巴韦林以同法同时进行测定。

2.2 药物对流感病毒B型和腺病毒(AdV3)抑制作用

MDCK细胞和HeLa细胞各5×108/L，每孔100μl，分别于96孔板中，37℃ 5% CO2培养箱培养，次日倾去孔中培养液.分别加入100 TCID50流感病毒B型于MDCK细胞孔中和100 TCID50 AdV3于HeLa细胞孔中，每孔100μl,37℃吸附lh后甩去上清，用PBS液洗2次，用二种药物的最大无毒浓度(TD0)为第一孔，再以无血清的DMEM液作2倍系列稀释6个浓度，分别加入上述已感染细胞孔内，每孔100μl,每个浓度重复4孔，两个实验系列分别设立药物对照，细胞对照和病毒对照,37℃ 5% CO2培养箱培养，倒置显微镜下每日观察CPE进展，以药物对照(-)，细胞对照(-)病毒对照CPE“++++”时计算结果50%抑制浓度。流感病毒B型在MDCK细胞上CPE特征为单层细胞变性变圆,AdV3在HeLa细胞为细胞肿胀变圆，折光度增强，聚集成不规簇状，固定染色后拍照。

2.3 药物治疗指数(n)按TI =TD50/ID50进行计算[3],TI值愈大,表明药物的安全范围愈大。

3 结果

3.1 药物对MDCK和HeLa细胞毒性作用以药物半数中毒量TD50和最大无毒量TD0来表示结果，见表l。

表l 药物对MDCK细胞和HeLa细胞毒性作用(mg/L)

可见二种药物高浓度时对MDCK和HeLa细胞均有一定毒性。试验结果表明药物抗病毒中用药物最大无毒量TD0，金石清瘟解毒口服液为50 mg/L、利巴韦林100 mg/L,以此浓度排除药物本身毒性对细胞影响，以保证结果的正确和可靠。

3.2 药物对流感病毒B型和AdV3的抑制作用及TI值大小

将金石清瘟解毒口服液和利巴韦林药分别作2倍系列稀释后，对100 TCID50流感病毒B型和AdV3进行抑制试验，计算药物对病毒抑制百分率及半数有效量IC50及TI值大小。结果见表2。

表2 药物对流感病毒B型和AdV3的IC50及治疗指数TI

4 讨论

急性呼吸道感染90%以上是由呼吸道病毒引起，大都为RNA病毒。流感病毒B型为流感病毒的一个亚型，由于流感病毒易不断发生抗原变异，预防性注射疫苗效果不够理想[4],对流感尚缺乏有效的药物。而AdV3是双股DNA病毒，最早是在原发性非典型肺炎患者的呼吸道标本接种于HeLa细胞中发现的，亦可造成不同人群中咽、结膜炎性发热性的流行[4]。本试验所选两种病毒分属RNA和DNA类病毒，测定其抗病毒谱的范围。本研究并严格按照卫生部药政局《新药临床前研究指导原则》的要求，以微量细胞培养法进行药物抗病毒试验，具有灵敏度高、便于观察、材料用量少、操作简便等优点。试验中选择了两种病毒和其对应的敏感MDCK和HeLa细胞株，并设立西药利巴韦林为对照组，每组还设药物对照和细胞对照及病毒对照，使观察的结果规范，具有良好可比性，重复实验3次(n=3)结果一致以药物定量反应法反应稳定。对RNA病毒流感病毒和DNA病毒AdV3之间IC50基本相似，说明该中药与利巴韦林对RNA和DNA病毒均同样具有较广的抗病毒谱。本研究仅对一种DNA病毒在体外细胞进行试验，应进一步对其它DNA病毒作抗病毒试验，以确定其抗病毒谱。至于体内药效是否与体外结果一致有待进一步研究。

[1] 周汉良,陈秀强.呼吸药理学与治疗学[M].第l版，北京：人民卫生出版杜.1998：604

[2] 中国医学科学院流行病防治所编.常见病毒实验技术[M].北京：科学出版让.1978：34-77

[3] 中华人民共和国卫生部药政局 抗病毒药效指导原则新药（西药)临床前研究指导原则汇编1993.164-179

[4] 顾方舟,曹逸运,董德祥,等译.病毒、立克次体及衣原体疾病诊断技术[M].第6版，北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社.1993：516-517.177-179.