一阶导数紫外光谱法测定人血浆中地西泮的血药浓度

周波林

广西壮族自治区北海市人民医院药剂科，广西北海 536000

地西泮（Diazepam）是临床上常用的镇静、催眠、抗惊厥药，在体内主要经肝脏细胞色素P450酶作用进行氧化代谢，具有遗传多态性和东西方人种之间的差异，临床上地西泮常用于控制肌痉挛和抽搐，如破伤风、癫痫发作、局部麻醉等，大剂量可引起外周神经肌肉阻断、呼吸抑制等不良反应，严重者可导致死亡[1]。该药物不但临床应用广泛，而且也是急诊药物中毒和自杀患者的常服药物。

此类药物在中毒药物中居首位，是因为地西泮药代学参数个体差异明显、治疗指数范围小，药物过量的典型表现有差异，而且药物中毒的发生和严重的程度与血药浓度呈正相关[2]，因此监测其血药浓度对临床治疗和中毒抢救均有重要意义。目前，对地西泮血药浓度检测的研究报道多为高效液相色谱法[3-5]，紫外导数光谱法检测地西泮血药浓度未见报道，本文建立了简便、快速、准确地测定血浆中地西泮浓度的新方法——紫外导数光谱法，为地西泮的血药浓度监测与药动学研究提供了新的分析手段。

1 仪器与试药

仪器MV-1201型双光束紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；BP-21lD型电子天平（德国SARTORIMS公司）；超声波发生器（上海 SBS2200）；地西泮化学对照品（中国药品生物制品检定所提供）；水为超纯水；甲醇（分析纯）；纯化水由广西壮族自治区北海市人民医院（以下简称“我院”）检验科提供；血浆由我院输血科提供。

2 方法与结果

2.1 测定条件及吸收光谱的选择

2.1.1 溶液的制备

2.1.1.1 血浆样品溶液的制备 将地西泮对照品适量在105℃下，干燥至恒重，精密称取10.61 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇适量，振荡2～3 min，加甲醇试剂至刻度，制得地西泮贮备溶液。精密量取地西泮贮备溶液2 mL，置于10 mL量瓶中，用空白血浆（阴性对照液）稀释至刻度，即得（含地西泮约21.22 μg/mL）。

2.1.1.2 地西泮对照品溶液的制备 将地西泮对照品适量在105℃下，干燥至恒重，精密称取10.61 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇适量，振荡2～3 min，加甲醇试剂至刻度，制得地西泮贮备溶液，备用。精密量取地西泮标准贮备液适量，制备地西泮对照品溶液（浓度：21.22 μg/mL）。

2.1.1.3 阴性对照液的制备 精密吸取空白血浆适量，加入3倍量甲醇沉淀蛋白，振荡3 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液备用。

2.1.2 零阶紫外扫描光谱

分别将血浆样品溶液（a液，含地西泮约21.22μg/mL），地西泮对照品溶液（b 液，浓度：21.22 μg/mL），阴性对照液（c液，空白血浆）进行紫外光谱扫描，波长范围为190～400 nm。光谱扫描条件：光度模式为Abs，扫描模式为单一，扫描速度为快速，光谱带宽为2 nm，采样间隔为0.1 nm。见图1。

从图1可以观察到，空白血浆与地西泮之间的紫外吸收有重叠，干扰较大，利用紫外分光光度法无法直接测定血浆中地西泮的含量。

图1 各溶液的零阶紫外光谱

2.1.3 一阶导数光谱及测定波长的选择

取“2.1.2”项下 a、b、c 溶液，进行紫外光谱扫描，波长范围为190～400 nm。对扫描后的紫外光谱进行导数微积分转换，分别得到3种溶液的一阶导数光谱。扫描条件同“2.1.2”项下，微分波长差为10；缩放系数为1。见图2。

由图2可见：血浆样品溶液（a液）在240.0 nm波长处的谷-零振幅图谱与地西泮对照品溶液（b液）相一致，而空白血浆（c液）在此波长处的谷-零振幅值为0，因此，测定地西泮血药浓度的检测波长可以定为240.0 nm。

2.2 线性关系考察

精密吸取地西泮标准贮 备液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，制成浓度（C）为 5.35～31.85 μg/mL 的系列工作液，以甲醇为空白对照，在240.0 nm波长处测定其一阶导数光谱的振幅值D，以浓度C对D进行线性回归，得回归方程：D=1.241×10-3C+3.0706×10-4（r=0.9979）。表明地西泮在 5.35～31.85 μg/mL 浓度范围内，其一阶导数振幅值D与浓度C呈良好线性关系[6]。

2.3 回收率试验

精密吸取按“2.1.1.3”项下制备的阴性对照液5 mL，分别精密加入浓度为 25.75 μg/mL的地西泮 5、10、15、20、25、30 mL，混匀，按照“2.2”项下测定 D 值，以D值代入回归方程计算含量，结果见表1。

2.4 精密度试验

取地西泮对照品溶液适量，在波长240.0 nm处重复测定地西泮一阶导数光谱的谷-零振幅D值，D值为 0.0274、0.0266、0.0278、0.0269、0.0273，RSD 为1.70%（n＝5），精密度符合规定。

2.5 稳定性试验

取血浆样品溶液按“2.1.1.1”项下配制后室温放置 0、1、2、4、6 h 后，分别于波长 240.0 nm 处测定谷-零振幅 D 值，D 值为 0.0405、0.0391、0.0387、0.0388、0.0376，RSD为2.67%（n=5），说明在6 h内血浆样品稳定性较好，对检测结果没有产生不良影响。

2.6 重复性试验

取相同浓度血浆样品5份，按“2.2”项下测定谷-零振幅D值，以D值代入回归方程计算含量，分别为26.50、26.18、27.30、27.06、25.93， 各样品中地西泮含量的平均值分别为26.48 μg/mL，RSD分别为2.18%（n＝5）。

3 讨论

地西泮治疗参数个体差异大、治疗范围小，而且药物中毒的发生和严重的程度与血药浓度呈正相关，因此，检测其血药浓度对临床治疗和中毒抢救均有重要意义。为了确保药物治疗的安全、有效，必须建立一种简单、灵敏、准确的地西泮血药浓度测定方法。

图2 各溶液的一阶导数光谱

表1 地西泮样品溶液回收率试验结果（n＝6）

3.1 检测方法的选择

紫外吸收光谱是由价电子的跃迁而产生的，由于具有不同分子结构的物质具有不同的官能团，因此会有选择性地吸收不同波长的光，这样就会产生吸收光谱的差异。因此物质的分子或离子产生的紫外光谱及吸收程度可以对物质的组成、含量和结构进行分析、测定、推断。紫外导数光谱是利用不同物质紫外吸收不同的原理，通过对紫外光谱进行微积分求导，达到清除物质相互干扰的目的，能够对混合物和复杂组分直接进行检测。目前，新型的紫外分光光度计均可利用紫外-可见分光光度计软件系统带有的数学处理功能，对吸收光谱进行处理，可以获得导数光谱。通常可以获得1～4阶导数光谱，在各阶导数光谱中，吸光度对波长的微分值与溶液中组分的浓度C保持线性关系，其中s为导数的阶数，通过电子学获得模拟导数光谱图，使其应用更加简化、普遍化[7]。

3.2 测定波长的选择

本实验在选定波长时，对所检测的溶液在200～400 nm范围内进行光谱扫描，可以观察到，空白血浆与地西泮之间的紫外吸收有重叠，干扰较大，利用紫外分光光度法无法直接测定血浆中地西泮的含量。通过导数光谱笔者发现血浆样品溶液（a液）在240.0 nm波长处的谷-零振幅图谱与地西泮对照品溶液（b液）的相一致，而空白血浆（c液）在此波长处的谷-零振幅值为0，因此，测定地西泮血药浓度的检测波长可以定为240.0 nm。

3.3 血浆蛋白沉淀剂的选择

本文在参考现有文献[8-10]报道的基础上，结合本单位现有设备条件，优化了血样处理方法：以甲醇代替乙腈，试剂价格相对低廉；以3倍血样量的甲醇为蛋白沉淀剂，辅以较高转速离心的方法处理血样，蛋白沉淀效果好，提取回收率高，适合紫外导数光谱测定地西泮血药浓度时使用。

3.4 方法学研究

线性化范围试验也叫标准曲线的绘制，实际是样品浓度（样品量）与响应值（吸光度、色谱峰或峰高、振幅）之间的线性关系，根据最小二乘法原理确定回归方程，判断回归方程是否有意义，主要靠相关系数（r）来判断，一般要求r在0.995以上。本实验利用6个浓度点，制定了线性方程[11]：D=1.241×10-3C+3.0706×10-4，r=0.9979，这表明地西泮在5.35～31.85 μg/mL浓度范围内，其紫外导数光谱振幅值D与浓度C呈良好线性关系，该回归方程可用于紫外导数光谱测定地西泮血药浓度。

回收率试验也叫加样回收率试验，是衡量误差或准确度的一种方法，是向试样中加入已知量的被测成分，然后进行对照试验，观察加入的被测组分能否定量回收，以此判断分析过程是否存在系统误差，加样回收率一般要求在95%～105%之间为宜[12]，本实验平均回收率是100.85%，符合实验要求。

精密度是指用相同方法对同一试样进行多次测定，各测量值彼此接近的程度。精密度用标准偏差（S）和相对标准偏差（RSD）来表示[13]，本实验精密度的RSD 为 1.70%（n＝5），符合实验要求。

重复性试验是指在同一实验室，由同一操作者使用相同的设备，按相同的试验方法，在短时间内对同一试样（或元件）相互独立进行的试验结果间的一致性[14]。 本实验精密度的RSD 为2.18%（n＝5），符合实验要求。

可见，本实验建立的方法，样品处理简单，操作方便，约10 min即可完成一个样品的分析，分析成本低。吸收峰与血浆药物浓度之间的线性关系良好，专属性强，精密度和准确度高，稳定可靠，为地西泮的药代动力学研究提供了可靠的分析方法，对开展地西泮药代动力学研究及治疗药物浓度监测有着重要意义，可供药代动力学研究及临床血药浓度检测使用。

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