异氟烷预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的线粒体机制探讨

沈 洁，刘 洋

0 引言

肝缺血再灌注损伤(Hepatic ischemic reperfusion injury，HIRI)是肝脏外科疾病中常见的病理过程。在肝脏移植、肝脏良恶性肿瘤、外伤等进行的肝部分切除等需要阻断入肝血流的手术中，不可避免造成肝缺血再灌注损伤，进而使肝解毒能力降低、微循环阻力升高，严重者可引起肝功能的损害甚至肝衰竭。对肝脏手术围术期的肝保护方面的研究也越来越受到麻醉医生和外科医生的关注。因此，对HIRI的研究具有重要的理论意义和实用价值。

预处理(Preconditioning，PC)作为机体内源性保护现象，在临床上越来越受到人们的关注。预处理分为缺血、缺氧预处理和药物预处理(应用某种药物而产生预处理作用)。由于缺血、缺氧预处理本身是伤害性应激过程，对机体是一种创伤，使其在临床上的应用受到限制。药物预处理具有相对安全、方便、剂量易于控制等优点，成为近年来研究的热点。线粒体三磷酸腺苷敏感性钾通道(Mitochondrial adenosine triphosphate-sensitive potassium channel，mitoKATP)在预处理中起着重要作用。研究发现，吸入麻醉药预处理(Volatile anesthetic preconditioning，VAPC)的心肌保护作用与mitoKATP开放有关。线粒体是一个结构和功能复杂而敏感的重要细胞器，在细胞凋亡过程中的多个关键性步骤都涉及线粒体。研究表明，缺血引起细胞不可逆损伤的根本原因是线粒体Ca2+超载，线粒体通透性转运通道(Mitochondrial permeability transition pore，MPTP)参与了神经损伤，并且是缺血再灌注所致脑细胞损伤的关键部位。随着药物预处理研究的不断深入，研究者发现，线粒体是多类药物作用的靶点，MPTP与mitoKATP通道在预处理中起着重要作用。

笔者前期对吸入麻醉药异氟烷预处理在鼠脑缺血再灌注损伤中线粒体介导的保护作用研究中发现，此保护作用与抑制MPTP、降低线粒体Ca2+超载有关［1］。而肝组织含有大量MPTP，其是否参与吸入麻醉药异氟烷对肝缺血再灌注损伤的保护作用尚不清楚。本研究通过对大鼠肝缺血再灌注损伤后MPTP及线粒体Ca2+浓度的检测，旨在探讨麻醉药异氟烷预处理在肝部分缺血再灌注损伤中的作用及线粒体介导的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物选择及分组 健康雄性SD大鼠75只，体质量280～350 g，由我院动物部提供，每组15只。随机分假手术组(S组)，缺血再灌注组(I/R组)，异氟烷预处理组(ISO组)，环胞菌素A(CsA，MPTP特异性阻滞药)+ISO组和CsA组。

1.2 实验方法

1.2.1 肝缺血再灌注模型的制作 建立大鼠肝缺血再灌注模型，10%水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔注射麻醉，采用腹腔弧形切口，充分显露第一肝门，入腹后分离肝十二指肠韧带，分离胆总管，应用无创动脉夹阻断肝左叶及后叶血流，造成70%肝脏缺血，但不阻断肝右叶血流，以防门静脉和胃肠道瘀血，60 min后松开动脉夹，再灌注120 min。整个实验过程利用灯泡加热，使直肠温保持在36.7～37.3℃。

1.2.2 异氟烷预处理 将鼠置于100 cm×100 cm×100 cm的实验舱里，使ISO浓度维持在1.2% ～1.5%，经进气孔吹入氧气，氧浓度维持在不低于21%(Datex气体监测仪监测)。

1.2.3 实验操作 S组:入腹后只分离肝十二指肠韧带，但不阻断肝门血供;I/R组:肝脏缺血60 min，再灌注 120 min;ISO组:肝脏 I/R前60 min ISO(雅培公司)预处理30 min，之后在空气中洗脱30 min。CsA+ISO组:CsA(sigma公司)50 mg/kg腹腔内注射，30 min后同 ISO组。CsA组:I/R前30 min CsA 50 mg/kg腹腔内注射。

1.2.4 取材及检测 各组大鼠于再灌注2 h后迅速断头处死，摘取肝组织置于冰块上，并用冰生理盐水冲洗，部分肝组织于液氮中保存，分离线粒体进行线粒体游离钙、MPTP含量检测。

(1)线粒体悬浮液的制备:低温差异法分离线粒体，用分离介质制成悬浮液。取组织块(0.5 g)在冰冷的生理盐水中冲洗，除去血液，滤纸吸干，称重，放入小烧杯中;用移液管取预冷的分离介质(0.01 mol/L 蔗糖、0.000 1 mol/L EDTA-2Na、0.01 mol/L Tris-Hcl、0.8%NaCL，pH=7.4)，体积总量是组织块重量的9倍，放入小烧杯内，用眼科小剪尽快剪碎组织块，用组织捣碎机以约10 000 r/min研磨制成10%组织匀浆;取10%组织匀浆用低温低速离心机以1 500 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清液以10 000 r/min低温高速离心机离心15 min，沉淀物为线粒体，线粒体用以上介质制成悬浮液。取该悬浮液少许，用中性红-詹纳斯绿B染色后，在高倍显微镜下观察，被染成亮绿色颗粒，即线粒体。整个过程均在0～4℃中进行。

(2)线粒体 Ca2+浓度的测定:根据 Mccormack［2］的方法改进，以 Fura-2/AM 为 Ca2+荧光指示剂，用日本850型日立荧光分光光度计测定线粒体Ca2+浓度，发射波长510 nm，以430 nm激发光谱扫描。根据实测荧光值(F)、最大(Fmax)及最小(Fmin)荧光强度比值计算出Ca2+浓度，［Ca2+］i=Kd{(F-Fmin)/(Fmax-F)}，Kd为荧光指示剂的介电常数，Fura-2=224 nmol/L，单位为 nmol/(mg·L)。

(3)MPTP的测定:利用MPTP增大时线粒体膜内外渗透失衡，导致吸光度明显减少的原理，用1601型紫外分光光度计(岛津公司，日本)，反应条件为25℃、pH=7.4，线粒体蛋白浓度为0.5 mg/mL。反应体系加入150 μmol/L的 Ca2+为激发剂，在540 nm波长处每分钟记录吸光度的变化，做吸光度的时间变化曲线，以达到平衡后的吸光度变化△S反映 MPTP开放的程度。△S越小，代表MPTP已经开放的程度越大。

1.3 统计分析 所有数据采用SPSS 18.0软件进行统计学处理，以±s表示，组内和组间比较均采用单因素方差分析和配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 线粒体游离Ca2+浓度的变化 I/R组线粒体游离Ca2+浓度明显高于S组和ISO组(P＜0.01);ISO组Ca2+浓度高于S组，但差异无统计学意义(P＞0.05);而CsA+ISO组线粒体游离Ca2+浓度明显高于ISO组(P＜0.01);CsA组与I/R组间差异无统计学意义。表明I/R后，肝脏组织线粒体Ca2+含量明显增加，ISO预处理可以抑制其升高，而这种作用在预先用MPTP特异性阻滞药CsA后被取消，见表1。

2.2 MPTP开放程度(ΔS)的变化 与 S组和ISO组相比，I/R组的ΔS明显降低(P＜0.01)，I/R组与CsA组和CsA+ISO组ΔS之间差异无统计学意义;与ISO组相比，CsA+ISO组的ΔS值明显降低(P＜0.01)，见表1。

表1 各组肝脏线粒体Ca2+浓度和ΔS值的变化(±s)

表1 各组肝脏线粒体Ca2+浓度和ΔS值的变化(±s)

注:*与S组比较，P＜0.05;#与I/R组比较，P＜0.05;▲与ISO组比较，P＜0.05

组别 例数 Ca2+［nmol/(mg·L)］ΔS值S组15 119.07±9.22 2.47±0.29 I/R组 15 157.01±6.63* 1.42±0.11*ISO组 15 122.27±6.67# 2.10±0.25#CsA+ISO组 15 153.48±6.24＊▲ 1.50±0.28＊▲CsA组 15 144.70±10.60* 1.62±0.22*

3 讨论

研究认为，导致细胞不可逆损伤的根本原因是线粒体Ca2+超载，线粒体是细胞内最大的钙池之一，且成为细胞存亡的控制中心［3］。Ca2+又是MPTP开放的主要诱发因子，过量的Ca2+超过线粒体自身的承受限度时，则促使MPTP开放，使线粒体基质代谢物丧失，膜电势消失，ATP耗竭，线粒体肿胀，造成细胞损伤。MPTP是反映线粒体膜完整及其功能的重要指标，是一种由线粒体内膜和外膜跨膜蛋白共同构成的高电导非选择性通道［4］，是一个至少由电压依赖性阴离子通道(Voltage-dependentanion channel，VDAC)、腺嘌呤核苷酸移位酶(Adenine nucleotide translocase，ANT)、F1F0 ATP合酶(F1F0 ATP synthase)、亲环蛋白D(Cyclophilin D，CypD)、环孢菌素 A(Cycloporin A，CsA)受体组成的多蛋白复合体。正常情况下，MPTP复合体仅允许相对分子量小于1.5×103的化合物通过，因此，其有维持线粒体基质和细胞胞质之间渗透压梯度的作用［4-5］。有研究发现，MPTP是缺血再灌注所致肝脏细胞损伤的关键部位，伴随着钙超载而发生的氧化应激，ATP的消耗及氧化磷酸化水平的提高，可以诱导线粒体内膜上的 MPTP形成，从而改变线粒体的通透性。MPTP开放以后，由于氧化磷酸化的解耦联及ATP的水解，导致线粒体功能障碍，最终导致细胞的凋亡或者死亡［5］。所以，减少线粒体Ca2+超载，抑制MPTP的开放，维持线粒体形态及功能正常，可能防止肝细胞死亡，起到肝保护作用。

肝脏 I/R损伤的发病机制十分复杂，其中Ca2+超载和MPTP开放是一个重要的原因［6-8］。在生理状态下，Ca2+作为细胞内第2信使，在维持细胞增殖、分裂、能量代谢、氧代谢方面发挥着重要作用。肝细胞Ca2+浓度约为0.2 μmol/L，细胞外液Ca2+浓度约为1.3 mmol/L，即肝细胞始终处于胞内1万倍浓度梯度的内环境中。细胞内Ca2+稳定的维持对于生命活动是至关重要的。本实验中，I/R组大鼠肝脏线粒体游离Ca2+浓度明显增加，表明肝脏缺血60 min，再灌注120 min后，对肝脏产生了明显的损伤;肝脏I/R时，细胞ATP减少，线粒体功能失常及细胞膜通透性增加，导致细胞内钙超载，从而激活磷脂酶C和磷脂酶A2，导致膜性结构的破坏;激活钙依赖蛋白酶，破坏细胞骨架与胞膜联接的完整性而导致细胞损伤［9-10］;线粒体钙超载对细胞产生的损伤是不可逆的。而I/R前给大鼠吸入麻醉药ISO进行预处理后，线粒体游离Ca2+浓度明显降低，防止了线粒体Ca2+超载，起到了一定程度的肝脏保护作用;另外，利用MPTP增大时线粒体膜内外渗透失衡，导致吸光度明显减少的原理，检测了各组MPTP开放程度，发现大鼠I/R后，肝脏线粒体MPTP大量开放，这可能是线粒体自身调节Ca2+稳态的不良后果，而Ca2+浓度增加又可诱发MPTP开放，产生正反馈的恶性循环;而进行ISO预处理后，大鼠的MPTP开放受到明显抑制，使线粒体游离Ca2+浓度降低，而Ca2+浓度降低又可抑制MPTP的开放，因此，减轻了I/R对大鼠肝脏的损伤，表明ISO预处理作用可能是通过抑制MPTP开放介导的。本研究设立了CsA组(药物空白对照)，其线粒体游离Ca2+浓度和MPTP结果与I/R组比较，差异均无统计学意义，说明特异性MPTP通道阻滞剂CsA本身对大鼠肝脏损伤没有作用;同时，对鼠进行ISO预处理前，采用特异性阻滞药CsA腹腔注射干预后，发现线粒体游离Ca2+浓度明显增加，MPTP大量开放，逆转了ISO预处理使线粒体游离Ca2+浓度降低及抑制MPTP开放作用，取消了ISO预处理的肝脏保护作用，进一步证明ISO预处理作用机制可能与抑制MPTP开放有关。

近年来，吸入麻醉药预处理和后处理作用一直是麻醉学研究热点之一，而其作用机制也不断有新的发现［11-13］。有研究表明，异氟烷后处理作用也可能与抑制MPTP、减少线粒体Ca2+超载有关。还有研究认为，caspase-3的活化及 metallothioneins-Ⅰ/Ⅱ起到了重要作用［14-15］。该研究结果表明，异氟烷预处理对肝脏缺血再灌注损伤具有一定程度的保护作用，这种作用可能与抑制MPTP开放、防止了线粒体Ca2+超载有关。笔者前期研究表明，ISO预处理对沙士鼠脑I/R损伤的保护作用可能是通过激活mitoKATP通道，使抗凋亡基因Bcl-2结合到线粒体膜上的量增加，同时阻止促凋亡基因Bax转录到线粒体膜上，从而抑制了MPTP的大量开放，发挥细胞保护作用。异氟烷预处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用是否也通过上调抗凋亡基因Bcl-2，同时防止Bax转录到线粒体，通过调节线粒体膜电位的的变化，影响MPTP，进而改变线粒体蛋白的释放，阻断凋亡途径，发挥细胞保护作用，还有待于进一步研究探讨。

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