人乳头瘤病毒E6／E7mRNA bDNA检测在宫颈疾病筛查中的应用

王少蕾 王筱红 罗丽雅 吴开锋 广东省博罗县妇幼保健院 516100

妇科常见恶性肿瘤其中之一为宫颈癌，其发病率较高，为女性肿瘤发病率的第二位。我国解放初期，巴氏涂片开展普遍，宫颈癌发病得到较好控制，巴氏涂片在宫颈癌筛查历史中起到了很大的作用。因近20余年来对于宫颈癌筛查不重视，宫颈癌发病有升高的趋势，且农村地区经济相对欠发达，农村发病率增高趋势更加明显。由于卫生知识等多方面因素，该病在较年轻妇女中发病亦趋增加，新发病例仍较高，占全世界发病率的28%。众多数据表明，导致宫颈癌发生的主要原因是人乳头瘤病毒（HPV）感染。众多流行病学、分子生物学等研究结果表明，宫颈癌的根本致病因素是人乳头瘤病毒（HPV）感染，HPV有百余种亚型，其中高危型 HPV与宫颈癌的相关性较高，有证据表明，其相关性要高于吸烟与肺癌的相关性，宫颈癌中95%是由它引起［1］。HPV与宫颈癌的关系因此受到医学界的广泛关注。在宫颈癌治疗方面，宫颈癌的治疗效果明显差于癌前病变。若能早期诊断和治疗宫颈癌前病变，患者的生存率及生存质量可明显提高，也可减少宫颈癌的浸润，降低宫颈癌的死亡率。目前国家重大公共卫生项目的两癌筛查（宫颈癌和乳腺癌）可早期筛查出宫颈癌前病变，以便于早期治疗，以达到上述目的。因此，宫颈癌的防治关键在于筛查出更多的癌前病变，以便于早期治疗，妇科普查工作的现实意义也在于此。目前宫颈癌的筛查方法较多，基于其HPV与宫颈癌的关系，笔者拟探讨基于HPV的检测手段来更好的早期发现宫颈癌前病变和宫颈癌。

1 对象与方法

1.1 对象 选取我县所辖乡镇2013年1－12月的两癌筛查农村妇女中经过初步筛查怀疑存在宫颈疾病者为研究对象，年龄30～65岁，平均年龄（40.2±7.3）岁。有子宫切除手术史或宫颈手术史，或有盆腔放射治疗史的剔除在外，且目前无妊娠，在取标本前无性生活达3d以上，亦无阴道冲洗及放药。

1.2 方法 对患者进行HPV E6／E7mRNA bDNA检测和TCT检测，最后均行宫颈病理学检查。

1.2.1 HPV E6／E7mRNA bDNA检测。（1）仪器和试剂：科蒂亚生物有限公司电热恒温鼓风干燥箱、冷光仪、宫颈高危HPV E6／E7mRNA检测试剂盒（即宫颈稳态检测试剂盒）。（2）操作方法：用细胞采样器的中央刷毛部分轻轻地深插入子宫颈管内，按同一个时针方向转动采样器5～8周后，将收集的细胞放入细胞保存液中。将标本移入离心管，3 000r／min离心5min后倒掉上清液，用2ml去离子水（ddH2O）清洗后再次离心，去上清液，达到标本同质化的目的。将已处理的有细胞的离心管中加入裂解混合液（200μl裂解液和400ml ddH2O，混合比例为1∶2），用移液枪吹打细胞团，使细胞分散悬浮，再加入5μl蛋白酶K。放入65℃恒温箱中放置1h，裂解过程中进行2～3次震荡，1h后取上清液用于检测（附注：多人份时裂解液的配置可以一次配置多量，按照细胞裂解液和去离子水1∶2的比例，如92人份：19ml裂解液＋38ml ddH2O。混匀后分别取600μl到标本中，切记蛋白酶K不能混合入上述稀释的裂解液中，每个标本单独加入固定的5μl）；从已制备好的标本裂解液中取出实验所需量。1例患者取50μl裂解后的标本用于检测。检测缓冲液配置→布板→信号放大→读板。从4℃冰箱取出底物复温。复温后加入底物催化剂31.5μl，手摇混匀。将杂交板从温箱中取出，掀开封板贴纸，用1×洗脱液200μl洗板洗3次。将所配底物每孔加入100μl，放入46℃温箱保温20min后取出，上科蒂亚冷光仪检测。将所读数据，转入数据处理软件进行电脑计算，结果将显示定性结果。

1.2.2 研究对象进行TCT检测。（1）使用TCT专门的采样器来采集子宫颈细胞样本；（2）获得脱落细胞后浸入液基细胞处理试剂中进行处理；（3）将有效细胞制备成细胞悬液，通过过滤离心方法清除黏液对制片的干扰，制成脱落细胞薄片；（4）用HE染色、巴氏染色或其他免疫组织化学染色等方法使细胞着色；（5）在显微镜下通过人工观察分析来检查阴道或宫颈的细胞形态。

1.2.3 研究对象进行病理学检查。在阴道镜下直接活检取材，取材后用福尔马林液固定后送广东省妇幼保健院病理科检测，得出病理学结果。

1.3 统计学处理 采用sigmastat3.1软件进行统计分析，不同程度宫颈病变中两种方法检测的阳性率比较采用χ2检验。以病理检查结果为参照分为正常组、CIN1、CIN2、CIN3、宫颈癌共五组，对比 HPV E6／E7mRNA bDNA、TCT两种检测方法在该五组中的准确度及假阳性率。

2 结果

不同人群HPV E6／E7mRNA bDNA、TCT检测结果的比较，见表1。

表1 不同人群HPV E6／E7mRNA bDNA、TCT检测结果的比较〔n（%）〕

本文对象共223例为可疑宫颈疾病患者，以最终病理学结果对其分为正常、CIN1、CIN2、CIN3、宫颈癌共五组，对该五组患者的HPV E6／E7mRNA bDNA、TCT检测结果进行比较，发现正常组中HPV E6／E7mRNA bDNA假阳性率为46.9%（15／32），明 显低于 TCT 的假 阳性率62.5%（20／32），P＜0.05，具有统计学意义。而CIN1、CIN2、CIN3、宫颈癌组的HPV E6／E7mRNA bDNA的阳性率均明显高于TCT组，P＜0.05，具有统计学意义。

3 讨论

HPV是DNA病毒的一种，其DNA分为3个部分，检测主要是早期基因区（E）。早期基因蛋白分为E1、E2、E4、E5、E6、E7等，其功能有病毒的转录、翻译调控和细胞转化复制，而主要的致癌基因为E6、E7。

HPV型别较多，有高危型、低危型，目前已发现的有百余种亚型，其中生殖道感染有近30种亚型，部分涉及肿瘤的发生。其中与子宫颈肿瘤有关的型常常是高危型HPV，低危与高危HPV分型与病毒导致宫颈癌发生的危险有关。其中低危型HPV感染是导致生殖道疣的主要原因。而高危型常引起宫颈癌及子宫颈上皮内瘤变（CIN）［2］，最常见的HPV分型是16、18亚型。有研究表明，地域性差异是HPV感染亚型分布的一个特点，如西方国家及非洲国家，16、18、58和52型引起的宫颈癌所占比例低于亚洲国家［3］。

宫颈黏膜属鳞状上皮组织，是HPV易感部位。宫颈细胞中的HPV DNA有两种存在状态：整合和游离状态。病毒存在的状态决定了宫颈病变的程度，DNA处于游离状态一般为癌前病变期，当DNA病毒与宿主细胞的染色体整合时，表明已进入癌症进展期。E6、E7基因有负相调节作用。因E2为结合位点启动，导致HPV E6、E7基因负相调节作用消失，细胞生长进入调控失常期，E6、E7基因发生表达异常。而HPV E6和E7蛋白在病毒复制中起到至关重要的作用，进而导致细胞的无限增殖和恶性转化［4］。p53Rb蛋白是细胞周期调节因子，当与E6、E7蛋白结合，就起到致癌的作用了。p53是肿瘤抑制的重要蛋白，是细胞生长周期中的负调控。当其基因表达上调时，会促进靶基因p21合成大幅度提高，抑制细胞增殖，这时宿主细胞DNA发生损伤。E6蛋白与细胞内E6－AP结合，再与p53特异性地结合在一起，进而水解，使其丧失了细胞生长负调节功能，从而引起细胞无限增生并向恶性转化［4，5］。有文献表明E6不仅和上述蛋白相互作用，同时还与靶蛋白1、p21、干扰素调控因子3相互作用，同时也参与细胞凋亡。E7蛋白转化蛋白，与肿瘤抑制蛋白视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）亲和力很高，Rb与E7结合使Rb－E2F复合物解离，游离出E2F，使转录因子立即发挥作用，细胞周期失控而发生永生化［4］。同时，E7还可以使得突变增加。这就是HPV致癌的机理。

在临床治疗来说，与宫颈癌前病变和微小浸润癌相比较，宫颈浸润癌治疗的难度远比癌前病变困难，部分患者的生活质量较差。宫颈癌是一种感染性癌症，如果通过选择一种好的筛查方法，及时发现癌前病变，可以高效阻断宫颈癌的发生。或发现微小浸润癌，也可以有效提高宫颈疾病患者的生存率和生存质量，这正是笔者寻找宫颈癌筛查手段的意义所在。

目前，宫颈癌的筛查已经作为我国重大公共卫生项目，开展较普及，因为成本问题，初步筛查的主要手段是巴氏涂片法，以TBS报告形式，或液基细胞学（TCT）检测，部分经济发达地区，采用HPV检测进行筛查，或者高危人群采取HPV检测，有学者也提出液基细胞学与HPV同时检测，但筛查费用较高，不适宜普及。宫颈癌筛查的方法还有阴道镜检查、组织病理学检查、血清学方法等［6］，损伤性、准确度太低、假阴性率高等都是上述方法的缺点。故此要寻找更好的办法以提高准确性。科学寻找宫颈癌筛查手段，以便于早期进行监测和干预，同时进行早期治疗，这对于降低宫颈癌的发病率和死亡率有不可估量的意义。

目前检测HPV－DNA的方法有，（1）聚合酶链反应技术：通用引物PCR；间接原位PCR；荧光定量PCR；实时PCR；PCR－ELISA检测，直接原位PCR；PCR结合双向点杂交技术检测，单管巢式PCR；竞争性定量PCR。（2）核酸杂交技术：斑点杂交法、80uthern杂交法、荧光原位杂交法等。（3）杂交捕获技术。（4）SP法染色检测 HPV早期蛋白E6［6，7］等基因芯片技术。这些方法具有各自的缺点，如标本的要求高，操作过程繁杂，且标本容易污染、假阳性较高；大规模应用于临床，价格昂贵。综上所述，为了提高特异性、降低假阳性率、提高准确率，又能够大规模用于筛查，兼顾价格的合理性，笔者必须寻找新的检测方法。

已经知道宿主细胞恶性转化的主要原因是致癌蛋白HPV E6／E7整合入宿主的基因组，导致E6／E7mRNA的表达失控，引起恶性转化，检测这种致癌基因的转录具有不必重复进行检测即能鉴定高危反复感染者的潜力［8］。在宫颈疾病的早期筛查中价值明显增高。

E6／E7存在于HPV中，是癌基因的片段。而导致宿主细胞恶性转化的是病毒癌基因转录产物mRNA［9］；宿主细胞本身不发生癌变的前提是癌基因不表达；宫颈上皮组织中具有癌基因活性的是HPV E6／E7mRNA；E6／E7可抑癌基因p53和Rb的降解，从而干扰细胞周期调节［10］；癌变水平与HPV E6／E7mRNA表达的多少成正比例关系。因此要对感染HPV高危型的妇女进行宫颈癌风险评估选用宫颈细胞中HPV E6／E7mRNA的检测更具意义。bDNA技术原理是基于“三明治”核酸杂交技术。此项技术优势：（1）扩增特点及扩增过程不是呈指数增长，从而稳定性高；（2）具有确定的放大倍数，重复性亦较高；（3）能精确的检测mRNA数量；（4）能监测其动态水平。传统技术中的不确定因素、过程复杂及种种缺陷在该方法中都被克服。直接用特定裂解液将样本裂解后，经探针杂交与信号放大即可得到结果，具有快速性及更高的精确度等优点。

本文表明HPV E6／E7mRNA bDNA在宫颈癌筛查中假阳性率明显低于TCT的假阳性率，而CIN1、CIN2、CIN3、宫颈癌组的HPV E6／E7mRNA bDNA的阳性率均明显高于TCT组，均有统计学意义。故此，人乳头瘤病毒E6／E7 mRNA bDNA检测是目前宫颈癌筛查中较好的方法，具有较好的准确度，假阳性率亦低，可能更能评估宫颈癌的发病风险。

［1］Bulk S，Berkhof J，Bulkmans NW，et al.Preferential risk of HPV16for squamous cell carcinoma and of HPV 18for adenocarcinoma of the cervix compared to women with normal cytology in the Netherlans〔J〕.Br J Cancer，2006，94（1）：171－175.

［2］刘光明，许廷贵.HPV感染与宫颈癌〔J〕.中华医学与健康，2007，4（4）：65.

［3］Woodman CB，Collins S，Winter H，et al.Natural history of cervical human papiuomavirus infection in young women：a longitudinal cohort study〔J〕.Lancet，2001，357（9271）：1831－1836.

［4］李华，高国兰.HPV与宫颈癌的研究进展〔J〕.实用癌症杂志，2007，22（4）：420.

［5］李索红，王全红.HPV与宫颈癌的研究进展〔J〕.肿瘤研究与临床，2005，17（6）：430.

［6］牛淑芳，吴素慧.人乳头瘤病毒检测的研究进展〔J〕.实用肿瘤学杂志，2006，20（2）：143.

［7］Keegan H，McInerney J，Pilkington L，et al.Comparison of HPV detection technologies：hybrid capture 2，PreTect HPVProofer and analysis of HPV DNA viral load in HPV16，HPV 18and HPV 33E6／E7mRNA positive specimens〔J〕.Virol Methods，2009，155：61－66.

［8］Rampias T，Routati E，Pectasides E，et al.Activation of wnt signaling pathway by human papillomavirus E6and E7oncogenes in HPV16positive oropharyngeal equamous carcinoma cells〔J〕.Mol Canccer Res，2010，8：433.

［9］McCloskey R，Menges C，Friedman A，et al.Human papillomavirus type 16E6／E7upregulation of nucleophosmin is important for proliferation and inhibition of differentiation〔J〕.J Virol，2010，84（10）：5131－5139.

［10］Ratnam S，Coutlee F，Fontaine D，et al.Clinical performance of the PreTect HPV－Proofer E6／E7mRNA assay in comparison with that of the Hybrid Capture 2test for identification of women at risk of cervical cancer〔J〕.J Clin Microbiol，2010，48（8）：2779－2785.