分析液相色谱仪检定方法和注意事项

2014-10-15李海英

科技传播 2014年3期

李海英

大同市质量技术监督局检验测试所，山西大同 037000

液相色谱仪是广泛应用在研究所，实验室等场所、对所研究样品进行分离分析的常规仪器之一。它的优点主要有：1）可以在短时间内把样品分析出来；2）对于所分析样品没有太多要求，只要能制成液体即可；3）不需要太多的样品就可以分析出来；4）对于各组分含量很少的样品也能分析出来。以上优点决定了该仪器在生物、医药、食品、材料等各领域研究工作的广泛应用。

1 液相色谱仪的原理

高压泵利用高压把流动相压进系统中，然后样品溶液从进入到流动相中，并跟随流动相运动，最终进入色谱柱中，由于样品溶液的各个组成物质具有不同的性质，在色谱柱中运动时会有一定的差异，经过一段时间的运动以后，运动速度差异会变得越来越大，这样就被分成多个部分分别从色谱柱中流出，这样在检测器中就记录下了这些样品组分的浓度，然后以图谱的形式呈现出来。

2 液相色谱仪的组成

液相色谱仪主要由加入样品系统、输送样品系统、分离样品系统、检测结果系统和结果分析处理系统组成。

2.1 样品加入系统

一般是用安装有隔膜的注射器或者是利用高压来加进样品，为了提高所分析样品的重复性，要在加样时注意使每次加入的样品量保持相同。

2.2 样品输送系统

高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分组成了输送样品系统。高压泵的一般压强为 14.7MPa～44MPa，如此高的压强可以使待分析样品液体以相当大的速度通过层析柱，较大速度可降低样品在层析柱中向四周扩散。贮存器和密度梯度仪的作用是使样品流动相随着所用固定相和样品的变化而变化，具体包括改变洗脱液的吸水性、阴阳离子浓度、PH值，这样就可使各种样品成分最终都可以实现有效的分离，增强分离的效果。

2.3 样品分离系统

首先，长度一般为1dm～5dm，内径为0.2cm～0.5cm的色谱柱、有时候需要有连接管和保持温度恒定的仪器等组成了样品分离系统。色谱柱的材料是不锈钢，、厚壁玻璃管、钛合金等。色谱柱内是半径为2.5μm～5μm的固定相，固定相中的基质材料是树脂或硅胶，它们的特点是有一定的化学惰性、多孔、比表面积大，另外还通过运用各种方法偶联上各种极性基团。这样就可以筛选出结构不同的多种物质。例如，如果上述硅胶表面被PSA偶联以后，就可以很轻松地把成纤维细胞中产生的一种糖蛋白分离出来。

其次，固定相中所装的物质粒度小，柱床特别容易达到均匀、致密的状态，这样就可以极大地降低扩散效应。这样就有利于缩小各个条带的宽度、并且提高分辨率。当然，这也正好符合了柱效理论。

最后，恒温器可以使仪器内的温度使从25℃升高到60℃左右，温度越高，样品在层析柱中传输的速度也就越大，分析时间也就减少，从而提高液相色谱仪的分析分离效率。

3 液相色谱仪各部分的检定方法和注意事项

液相色谱仪是高精度仪器之一，其检定需要根据《液相色谱仪》的相关规定来进行，这一部分内容是国家计量检定规程（JJG705-2002）中独立的一部分。接下来简单介绍一下常规检定项目的检定方法及注意事项。

3.1 泵流量设定量误差Ss和流量稳定性误差SR

3.1.1 检定方法

泵流量的检测是根据液相色谱仪上标定的流量标准来设定好标准流量，然后打开仪器，按照正确的操作步骤进行操作，等到压力趋于稳定以后在规定的时间内收集流动相于处理过可以直接使用的容量瓶中，同时由同一个人计时，在规定的时间内收集好流动相（以上操作重复三次），然后在分析天平上称量所收集的流动相的质量。按照公式

3.1.2 注意事项

收集流动相和计时要由同一个人来完成，这样就可以减少不同时而造成的计时误差；由于甲醇是极易挥发的液体，所以在收集的过程中要密封，收集好以后立即称重，称重结果要换算成体积然后保留小数点后三位有效数字；这一过程要重复至少三次以减少偶然误差，增强结果说服力。

3.2 色谱柱温箱温度的检定

3.2.1 检定方法

在色谱柱温箱内固定一个温度计，使温度计的探头能够测量色谱柱的温度。分别选择35℃和45℃作为检测温度进行检定。按照液相色谱仪的操作规程操作，等到温度稳定在一定值时，记录下温度计的读数，与此同时开始用秒表计时，每隔10min记一次读数，总共记录7组数据，然后求出算术平均数，算数平均数与所设定的35℃或45℃的差值就是柱温箱温度设定值误差ΔTs，而读数中最高温度与最低温度的差值是控温稳定性Tc。

3.2.2 注意事项

温度的升高在通常情况下会加大理论塔板数，峰和峰之间的距离变小，但是要保证每个峰的面积不变，所以在峰距变小的情况下，峰的高度就会增高，所以温度升高会使保留的时间变短，而温度降低正好相反。

3.3 基线噪声与基线漂移的检定

3.3.1 检定方法

在进行这个项目的检定时，用C18作为色谱柱的材料，用无水甲醇作为液相色谱仪中的流动相，设定适当的高压使流速为1.0dm3/min，并且使仪器处于最灵敏的状态，记录纸的移动速度设定为0.5～1cm/min。按照正确的操作步骤操作，待稳定运行半小时后，根据检测器的衰减倍数和对应的标度来算基线噪声。所用的公式是Nd=KB。基线漂移的值是在一个小时内检测器基线偏离坐标原点的距离。

3.3.2 注意事项

在进行此项目鉴定时，仪器中不能有无水甲醇以外的其他物质作为流动相；如果基线处于非正常状态，那么需要排除故障使仪器处于正常工作状态，这样测定的值才具有真实性；在测得基本的数据以后，要注意在计算过程中换算各个数据的单位，否则所得结果将是不正确的。

3.4 最小检测浓度的检定

3.4.1 检定方法

3.4.2 注意事项

在计算的时候，分母中的“20”是按照20的进样体积计算，而不是按照浓度来计算的。

3.5 整机性能的检定

3.5.1 检定方法

首先使整个仪器处于正常工作的状态，按照仪器本身所配置的检测器来选择测量参数：紫外检测器和二极管阵列检测器用无水甲醇作为流动相，流量设定在，波长值设定为254nm，0.04的灵敏度，待基线稳定后加入5µ～10µ的萘∕甲醇标准溶液；荧光检测器则与上述两个检测器不同，它所用的流动相是85%的甲醇溶液，流量相同，两个波长值分别是345nm、455nm，灵敏度值选择居中的档位，待基线稳定后加入相同体积的硫酸奎宁/高氯酸水溶液；折光率检测器用无水乙醇做流动相，流速值、灵敏度值选择的选择与荧光检测器的相同，加入5～10µ1kg/L的丙三醇溶液。以上各检测器的检测值要得到六组，并记录峰的保留时间和峰面积，按照下面的公式计算RSD。

3.5.2 注意事项

要使仪器处于正常工作中，这样才能使得数据具有说服力。要真实记录各组数据。