铽-洛美沙星稀土敏化荧光增强法测定诺氟沙星

刘保生，种宝红，李志云，曹世娜

（河北大学化学与环境科学学院，河北保定 071002）

铽-洛美沙星稀土敏化荧光增强法测定诺氟沙星

刘保生，种宝红，李志云，曹世娜

（河北大学化学与环境科学学院，河北保定 071002）

采用稀土敏化荧光增强法，对诺氟沙星的含量进行了测定.研究表明，在pH 6.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，洛美沙星能够与Tb3＋结合发生共振能量转移.其最佳激发、发射波长分别为λex＝320nm，λem＝545nm.在该体系中加入诺氟沙星，可使其荧光进一步增强，据此建立了测定诺氟沙星含量的新方法.结果表明：该方法测定诺氟沙星含量的线性为4.0×10－8～1.0×10－6mol／L；方法检出限为8.4×10－9mol／L.将该方法用于诺氟沙星胶囊及尿样中诺氟沙星含量的测定，平行6次测定相对标准偏差分别为2.50%～4.69%和2.52%～4.40%；回收率分别为94.5%～105.6%和91.2%～96.5%，结果满意.

铽；洛美沙星；诺氟沙星；稀土敏化荧光增强法

镧系离子具有特殊的4f电子结构，能够与喹诺酮类药物结合形成m＊→m发光配合物，发射镧系稀土离子强的特征荧光，即所谓的稀土敏化荧光.该荧光具有Stokes位移大、谱线窄、寿命长、背景干扰小等特点［1］.已报道的方法通常是利用敏化荧光的猝灭进行其他物质的测定，而本方法是利用敏化荧光的再增强进行其他物质的测定.

诺氟沙星（norfloxancin，NFLX），亦称氟哌酸，是第3代喹诺酮类抗生素，具有抗菌谱广、作用强等优点［2］.其含量测定方法有高效液相色谱法［3］、紫外分光光度法［4］、电化学分析法［5］、荧光法［6］等.高效液相色谱法设备成本高，试剂用量大，检测费时、费力.紫外分光光度法灵敏度较低，不利于痕量测定.荧光光度法具有灵敏度高、选择性好、操作简便等优点.本实验以洛美沙星-Tb3＋作为荧光探针，建立了NFLX含量测定的新方法，可不经分离直接用于尿样及胶囊样品中诺氟沙星含量的测定，对稀土的研究及其在分析中的应用有一定的拓展作用.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

日本岛津RF-5301PC荧光分光光度计；上海雷磁分析仪器厂pHS-3C型酸度计；洛美沙星（LMX，中国药品生物制品检定所）溶液：1.0×10－3mol／L，用时稀释成1.0×10－5mol／L工作液.诺氟沙星（中国药品生物制品检定所）溶液：8.0×10－4mol／L，使用时稀释为4.0×10－6mol／L.氧化铽（Tb4O7，＞99.9%）配制Tb3＋溶液［7］：准确称取0.748 1g Tb4O7固体于小烧杯中，加入少量体积比1∶1浓盐酸，加热至溶解，然后将溶液蒸发至近干，自然冷却至产生结晶，以水溶解并定容至100mL容量瓶中，配成4.0×10－2mol／L的Tb3＋储备液，使用时将其稀释为4.0×10－3mol／L.以上药品均于4℃避光保存.醋酸-醋酸钠缓冲溶液（0.1mol／L HAc及NaAc混合而成），实验用水为二次石英蒸馏水，所用药品为分析纯.

1.2 实验方法

于10mL比色管中，依次加入一定量pH为6.0的HAC-NaAc缓冲溶液，1.0×10－5mol／L洛美沙星工作液，4.0×10－3mol／L Tb3＋溶液，4.0×10－6mol／L诺氟沙星溶液，用水定容，摇匀静置20min，在入射和出射狭缝均为5nm，λex＝320nm，λem＝545nm处，用1cm比色池测定荧光强度或扫描光谱图，同时做相应的试剂空白.

2 结果与讨论

2.1 洛美沙星-铽-诺氟沙星体系的荧光光谱

体系的荧光光谱见图1.表明：Tb3＋单独存在时荧光极弱，Tb3＋与LMX反应在489，545，584，622nm处出现Tb3＋特征发射峰，其中较强峰在489nm（5D4→7F6跃迁）和545nm（5D4→7F5跃迁）；584nm（5D4→7F4跃迁）和622nm（5D4→7F3跃迁）［8］处的峰荧光强度较弱.同时LMX 435nm的荧光强度大幅度降低，由此可知，LMX将自身的能量有效传递给Tb3＋，进而敏化Tb3＋的荧光，与Tb3＋水合离子相比较极大地提高了Tb3＋的发光强度，即发生了稀土敏化荧光.同时在LMX-Tb3＋中加入NFLX，体系的荧光强度进一步升高.据此可以建立以LMX-Tb3＋稀土敏化荧光体系为荧光探针的测定痕量NFLX的新方法.Tb3＋离子本身的激发波长在270～290nm之间，为了避免对Tb3＋的激发，将络合物的激发波长选择为LMX的最佳激发波长320nm，以Tb3荧光最强处的发射波长545nm为荧光测定波长.

2.2 酸度的影响

喹诺酮类药物分子中含有3-羧基-4-氧喹诺酮环系及哌嗪取代基，使得分子中的氮原子与氧原子在不同pH溶液中的质子化程度不同，这直接影响分子电子云分布.在碱性溶液中，Tb3＋易水解生成铽的氢氧化物沉淀，在强酸性溶液中，由于－COOH不易电离而难以形成络合物［9］.在近中性环境中，喹诺酮类药物主要以两性离子形式存在.因此本实验在弱酸性条件下考察pH值对体系荧光强度的影响，结果见图2.图2表明：pH在5.6～6.22时体系的荧光强度最大并保持稳定.本实验选取pH为6.0作为体系反应的最佳酸度.

图1 体系荧光光谱Fig.1 Emission spectra

图2 缓冲溶液酸度对体系的影响Fig.2 Effect of buffer solution acidity on the system

2.3 缓冲溶液用量的影响

固定pH为6.0，实验了不同缓冲体系Tris-HCl，HAc-NaAc，NaH2PO4－Na2HPO4中Tb3＋与LMX及NFLX的反应情况，发现磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中因所含的PO3－4使Tb3＋产生沉淀，且在醋酸-醋酸钠Tb3＋与LMX及NFLX的能量转移效果最好，适宜用量为0.5～1.5mL（图3）.故本实验选用pH＝6.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液0.8mL.

图3 HAc-NaAc缓冲溶液用量对体系的影响Fig.3 Effect of buffer solution's volume on the system

2.4 洛美沙星、Tb3＋用量的影响

固定LMX浓度为1.0×10－6mol／L，NFLX浓度为4.0×10－7mol／L，改变Tb3＋浓度，考察Tb3＋浓度对体系荧光强度的影响.结果表明，随着Tb3＋浓度增加，Tb3＋的特征荧光强度增大，而435nm处LMX的荧光强度减小.当［Tb3＋］／［LMX］≥200时，体系荧光强度趋于恒定.本实验采用4.0×10－3mol／L Tb3＋溶液，用量为1.0mL.

固定NFLX浓度为4.0×10－7mol／L，Tb3＋浓度为4.0×10－4mol／L，改变LMX用量实验其对体系荧光强度的影响.结果表明：当LMX用量为8×10－7mol／L～1.5×10－6mol／L体系的荧光强度趋于恒定.本实验采用1.0×10－5mol／L LMX溶液最佳用量为1.0mL.

2.5 稳定性实验

按实验方法配制溶液，当溶液放置15min之后体系的荧光强度保持稳定，且在2h内基本保持不变.表明：体系荧光强度受溶液放置时间影响较小，实验选择反应20min进行测定.

2.6 干扰实验

当NFLX浓度为4.0×10－7mol／L时，体系荧光强度的变化不超过±5%时考察外来物质的干扰情况.结果表明：5 000倍的K＋，Na＋，Zn2＋，Pb2＋；1 000倍的NH＋4，淀粉；500倍的Fe3＋，Al3＋，Ca2＋，Mg2＋，Ba2＋，糊精；100倍的葡萄糖，但其他喹诺酮类药物的存在对本实验干扰严重.

2.7 工作曲线与检出限

按实验方法操作，改变NFLX标准溶液的用量.NFLX溶液浓度在4.0×10－8～1.0×10－6mol／L内与荧光强度呈良好的线性关系.其线性回归方程为ΔF＝4.71×108c＋126.48，相关系数r＝0.999 7.按3σ／K的方法求得该方法的检出限为8.4×10－9mol／L（n＝11）.将本方法与目前检测NFLX的光度法对比，见表1，可知本方法灵敏度较高.

表1 文献报道光度法测定诺氟沙星的方法Tab.1 Comparison with the determination methods of norfloxacin

2.8 样品分析

2.8.1 尿样中诺氟沙星含量的测定

鉴于口服NFLX后有相当一部分的药物随尿液排出，因此测定尿液中的NFLX含量，对NFLX的药代动力学及药效学研究具有重要意义.用移液管取不同人的新鲜尿液各10.0mL于100mL容量瓶中定容，准确量取一定量的该尿液按实验方法测定NFLX含量，结果为未检出.进行加标实验，结果见表2.表明：本方法可不经分离直接用于尿液中NFLX含量的测定，结果满意.2.8.2 诺氟沙星胶囊中诺氟沙星含量的测定

表2 尿液中诺氟沙星含量及其回收率测定结果（n＝6）Tab.2 Urine sample determination result and returns-ratio（n＝6）

取不同批号或不同厂家的诺氟沙星胶囊各1粒研磨均匀，加入适量0.1mol／L醋酸使之溶解，并分别转移到100mL容量瓶中定容.静置一段时间后取上清液进行适当稀释，移取一定量的该溶液，按实验方法测定NFLX含量，并测定方法回收率，测定结果见表3.表明：本方法可不经分离直接用于胶囊中NFLX含量的测定，测定结果显示所测药品的有效成分含量均符合中华人民共和国药典规定的含量范围.

表3 诺氟沙星胶囊中诺氟沙星含量及其回收率测定结果（n＝6）Tab.3 Capsule sample determination result and returns-ratio（n＝6）

3 结论

利用稀土敏化荧光技术，建立了荧光光度法测定制剂和尿液中诺氟沙星含量的新方法，由于稀土荧光Stokes位移大、谱线窄、稳定、背景干扰小等特点，使得该方法灵敏度高，选择性好，重现性好.该研究进一步发展了稀土元素在荧光分析中的应用.

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（责任编辑：梁俊红）

Application of terbium-lomefloxacin sensitized fluorescence for the determination of norfloxacin

LIU Baosheng，ZHONG Baohong，LI Zhiyun，CAO Shina
（College of Chemistry and Environmental Science，Hebei University，Baoding 071002，China）

A simple，rapid and sensitive spectrofluorimetric method for the determination of fluoroquinolone antibiotics，norfloxacin，is described.This method makes use of the radiative energy transfer from fluoroquinolones to terbium ions in weakly acidic solution.In the acetic acid-sodium acetate buffer solution of pH＝6.0，terbium（Tb3＋）and lomefloxacin react and combine as steady complex under room temperature.The Tb3＋-lomefloxacin complex enhance the characteristic fluorescence of the Tb3＋.The maximum excitation wavelength and maximum emission wavelength is atλex＝320nm andλem＝545nm，respectively.The fluorescence intensity increased with norfloxacin added，while the locations of the excitation and emission wavelengths stayed the same.According to this，a new way to determine the concentration of norfloxacin was established.Optimum conditions for the formation of the complexes were investigated.The concentration of norfloxacin presented a nice liner relation with the fluorescence intensity under the range from 4.0×10－8mol／L to 1.0×10－6mol／L.Under optimum conditions，the detection limit of the method was up to 8.4×10－9mol／L.This method was successfully applied to determine norfloxacin in capsule and urine.The relative standard deviation was 2.50%—4.69%and 2.52%—4.40%for 6parallel determinations of norfloxacin samples and the recoveres were 94.5%—105.6%and 91.2%—96.5%，respectively.It can be used directly for the determination of norfloxacin in urine and capsules without isola-tion.There is certain guiding significance for the expansion of the research about the application of rare earth elements in the fluorescence analysis.

terbium；lomefloxacin；norfloxacin；rare earth-sensitized fluorescence enhancement

刘保生（1963-），男，河北保定人，河北大学研究员，主要从事分子发光理论与应用研究.E-mail：lbs＠hbu.edu.cn

O657.3

A

1000 1565（2014）05 0485 06

10.3969／j.issn.1000 -1565.2014.05.008

2014-03 -12

国家自然科学基金资助项目（206275024）；河北省重点基础研究项目（10967126D）.