染色、透明时间影响姜片吸虫标本制作效果研究

吴家斌，余细莲

（江西农业大学动物科学技术学院，江西 南昌 330045）

姜片吸虫病是布氏姜片吸虫寄生于人和猪的小肠内引起的一种人畜共患病，严重危害着儿童健康及仔猪生长发育[1、2]。为减少经济损失，从教学科研入手探寻姜片吸虫病诊断、防治的新方法，标本制作在寄生虫病的教学科研中发挥着十分重要作用[3]。寄生虫标本特别是蠕虫标本制作，常因采集活虫体标本的时间、数量等条件因素的限制，不能及时全部进行染色制片，采用不同固定液保存后，待需要时进行染色制片。吸虫类染色标本制作过程包括固定、染色、脱水、透明和封片等5个步骤。但具体到不同虫种，实际操作步骤亦有所不同。本试验以福尔马林固定20多年的姜片吸虫和德氏苏木素染液，虫体较大而肥厚，染色标本制作难度较大。目前，未见有关姜片吸虫染色片制作的报道。本研究旨以长期固定的较大肥厚虫体，制作永久性染色标本提供理论依据。

1 材料

1.1 虫体

福尔马林固定20多年的姜片吸虫（江西农大动科院寄生虫实验室提供）。

1.2 染料及药品

苏木素、无水酒精、二甲苯、36%盐酸、浓氨水、甘油、铵明矾、中性树胶。

1.3 器具

解剖镜、数码相机、托盘天平、玻片镊、1.5mm厚载玻片、3mm厚载玻片（自制）、盖玻片（自制）擦镜纸、定性滤纸（直径12cm）、烧杯（500mL、250mL）、刻度吸管（10mL），洗耳球（中号）量筒（100mL）、扁形称量瓶（50mL）、玻璃漏斗（直径12cm）、铁三角架、棕色试剂瓶（250mL）、文件夹子（中号）、滴管（胶头）。

2 方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 脱水液。洗耳球及刻度吸管分别吸取无水酒精6mL、10mL、16mL、18mL、19mL、20mL于扁形称量瓶中，又分别吸取蒸馏水14mL、10mL、4mL、2mL、1mL、0mL依次兑加，配制30%、50%、80%、90%、95%、100%酒精溶液标记备用。

2.1.2 染色液。天平称取苏木素2g，倒入含有12.5mL 95%酒精的500mL烧杯中，向其中加入200mL的饱和铵明矾溶液(约含铵明矾11%），将此混合液曝露于日光及空气中3～7d或更长时间,待其充分氧化成熟，再分别加入甘油、甲醇各50mL保存，并待其颜色充分变暗，经定性滤纸置铁三角架上的玻璃漏斗中过滤，滤液用烧杯接装后倒入棕色试剂瓶中标记备用。

2.1.3 退色液。洗耳球及刻度吸管分别吸取无水酒精、蒸馏水、盐酸各35mL、15mL、1mL于250mL烧杯中混匀，倒出约20mL于扁形称量瓶中标记备用。

2.1.4 透明液。倒出约20mL二甲苯于扁形称量瓶中标记备用。

2.2 虫体固定液的脱去

玻片镊取出福尔马林固定多年的姜片吸虫于烧杯中，加满清水浸泡24h后分别移入70%、50%、30%酒精浸泡各1h。

2.3 虫体制薄

玻片镊取出已脱去固定液的1条虫体于两块自制载玻片之间，以文件夹子夹住，使虫体受力逐渐增大、均匀，整体浸泡水中24h或更长时间，观察虫体相当薄时可卸掉文件夹子取下虫体进行染色制片。

2.4 试验分组

虫体染色、透明时间，综合参考唐爱芬、肖芳萍、徐会梅、孔繁瑶[4～7]对吸虫标本制作方法改进设定。试验共分9组，每组3个虫体重复。染色时间设为16h、22h、28h，每个染色时间又分16h、22h、28h不同透明时间。

2.5 染色标本制作[4]

洗耳球、刻度吸管吸取染色液2mL于扁形称量瓶中，兑加20mL蒸馏水将染色液稀释10倍；虫体置染色液中分别经16h、22h、28h取出，蒸馏水冲洗后分别通过30%、50%、70%酒精依次经35min、40min、45min脱水；移入退色液（酸酒精）中，退色时间以观察虫体表面呈淡红色，内部构造呈深红色，颜色深浅分明为好；虫体分别移入80%、90%、95%、100%依次经40min、30min、50min、60min后再移入二甲苯中透明，透明时间分别为16h、22h、28h；取出虫体置载玻片上，滴加适量中性树胶，加盖自制盖玻片封固。

2.6 标本效果评定

解剖镜下观察姜片吸虫形态结构，每个虫体按口吸盘、腹吸盘、盲肠、卵黄腺、梅氏腺、卵巢、子宫及睾丸8个器官结构清晰度给分，清晰的给2分，隐约可见的给1分，不见的给0分，每组3个虫体重复，每组虫体总得分为48分（2×8×3＝48），以每组虫体器官结构的清晰度为效果评判标准（清晰度＝实得分／总得分×100%）。

3 结果

3.1 染色、透明时间对各组虫体器官结构清晰度影响情况

染色16h、22h、28h中的透明22h的清晰度分别以89.6%、83.3%和75%为最高，其中又以染色16h、透明22h时清晰度89.6%为最高，标本效果最好；3个染色时间内的3个透明时间姜片吸虫的8种器官结构以卵黄腺清晰度均为100%为最高易着色，卵巢、盲肠清晰度最低（详见表1和图1）。

表1 染色、透明时间对各组虫体器官结构清晰度影响情况

图1 染色、透明时间对各组虫体标本清晰度影响情况

3.2 染色标本制作要点

试验研究表明，按以下步骤、方法制作染色标本，效果较好（详见表2）。

表2 姜片吸虫染色标本制作技术要点

3.3 染色效果观察

腹吸盘位于虫体前端，呈漏斗状，大小是口吸盘的4～6倍。口吸盘后接咽和食道及两条盲端的肠管，肠管弯曲不分枝，直达虫体末端。腹吸盘的后方有弯曲的子宫，子宫内充满虫卵。卵巢位于子宫与梅氏腺之间，呈佛手状。卵黄腺呈颗粒状密布于虫体两侧，卵黄腺管与梅氏腺相连。两个高度分支的睾丸前后排列在虫体后部中间（详见图2、图3）。

图2 姜片吸虫染色标本（10×1倍）

图3 姜片吸虫各器官结构（5×4倍）

4 分析与讨论

4.1 试验特点

虫体固定液脱去、虫体制薄、染色、脱水、脱色、透明、装片等步骤，仍处于摸索试验阶段，每个步骤顺序及处理时间均直接影响制片效果。尤其染色对象是福尔马林固定20多年的姜片吸虫，虫体较大、较厚，弹性差、易破损，虫体制薄受压后染液及透明液难于渗透，染色标本制作难度增加，合理调整染色及透明时间是染色标本制作关键。

4.2 体会

各种虫体标本可长久地浸于甲醛液中保存，但在染色前均须重新放置于70%、50%、30%酒精后才能用于染色；虫体制薄是长期浸于甲醛液中姜片吸虫染色片制作关键，采用文件夹子逐渐施压虫体，渐渐变薄，不然虫体易破碎；染色使用的染液是德氏苏木素染液，其染色时间染色时间为16h；脱色以肉眼观察虫体表面为淡红色，时间约为5～12min；通过30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%酒精脱水时间依次为 35min、40min、45min、40min、30min、50min、60min；透明时间为22h；制片效果较好。

4.3 出现的问题及解决办法

比对课本介绍的制作方法进行标本制作，标本的颜色过浅，不易在显微镜下观察。经研究分析，颜色过浅原因：一是由于肥厚虫体制薄受压后细胞间隙变小，染液不易渗透而着色困难，二是染色时间较短、脱色时间较长，调整时间后标本的着色效果良好。其次，标本观察中出现结构层次不明显、界限模糊的现象，改善透明时间后，标本的结构层次明显。再次，有的标本制成后发现有的虫体边缘破损和起雾现象，破损原因是虫体固定时间较长弹性较差，制薄受压过大过急。而起雾原因是酒精梯度脱水时间不当，改善后问题被解决。

[1]李国清主编，兽医寄生虫学(双语版)[M].北京：中国农业大学出版社,2006(7):113～114.

[2]汪明主编，兽医寄生虫学.[M].第3版，北京：中国农业大学出版社,2004(1):266.

[3]赵辉元主编，家畜寄生虫与防制学[M].长春：吉林科学技术出版社，1996(7).

[4]唐芬.肝片形吸虫制片标本的制作技术[J].山东畜牧兽医.2009,30(3):9～11.

[5]肖芳萍.不同保存期吸虫标本胭脂红染色时间的比较[J].中国兽医科技，2002(32)：41.

[6]徐会梅.片形吸虫标本制作方法改进[J].山东畜牧兽医，2006(1).47～48.

[7]孔繁瑶主编.家畜寄生虫学(第1版)[M].北京：中国农业学出版社，1981(6):472～473.