DNA自组装技术及其在电离辐射检测中的应用

张宏陆 李 凡 柳华杰 晁 洁

（中国科学院上海应用物理研究所 嘉定园区 上海 201800）

自组装在自然界中是普遍存在的。构成一个系统的基本单元，如原子、分子、纳米粒子、生物大分子甚至宏观的材料，能够在没有人为干扰的情况下通过非共价键的相互作用自发地形成一种稳定有序的结构，这就是自组装。生命体内磷脂分子构成细胞膜、细胞聚集形成生物组织、组织再组合形成生命体都是自组装现象。自组装是一种自下而上(Bottom-up)的技术，其可分为热力学自组装和编码自组装两种主要类型，而 DNA分子自组装是编码自组装的一种。

DNA是生命信息的载体，同时也作为一种理想的材料而被广泛的用于构建各种纳米尺度的结构。DNA本身具有很有吸引力的结构性质，构成DNA的碱基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(G)之间简单的 Watson-Crick互补配对原则的特异性和可预测性，使其拥有巨大的信息编码能力；纳米级的尺寸（对于常见的B-DNA，直径在2nm，一个螺旋周期在3.3nm）；DNA的双链结构具有很好的刚度，持续长度约50nm（15个螺旋），而单链结构拥有很好的柔韧性，持续长度约1nm（3个碱基长度）；DNA的化学性质很容易被人工合成并被各种核酸酶和连接酶所操纵，通过成熟的PCR技术还可以实现对DNA的指数级扩增。

DNA自组装技术或者称为DNA纳米技术源自美国科学家Seeman[1]在20世纪80年代提出来的一个想法：利用 DNA的碱基互补所形成的周期性规律结构作为蛋白等其他分子结晶的框架，这样可以为晶体学提供一个理想的研究工具。最开始Seeman所采用的结构单元是模拟DNA同源重组中的Holliday交叉结(Holliday junction)，它是由4条单链 DNA两两部分互补形成的四臂分支结构。这种 Holliday结构本质上就是交叉结构(Crossover)，而交叉结构才是 DNA自组装结构的最基本单元，之后发展的各种自组装技术无一不是基于交叉结构或其变体而发展的。单单从这一方面讲，Seeman就无愧于“DNA纳米技术之父”这一荣称，更不用说他在之后推动这一领域发展的所做出的重要工作了。

在DNA自组装技术快速发展的这20多年里，主要分为2条主线：结构和动态DNA纳米技术。结构DNA纳米技术就是利用DNA作为基本材料构建稳定平衡的静态结构，包括各种二维、三维结构。根据自组装方法还可以分成 3类：基于拼块(Tile)结构的自组装、基于折纸(Origami)的自组装和基于单链“砖块”(Single-strand brick)的自组装。利用这3种方法都可以构建二维和三维结构。

1 DNA自组装技术

1.1 结构DNA自组装技术

1.1.1 拼块DNA自组装

基于Hollidy交叉结Seeman组[5]设计出了DX(Double crossover)拼块结构，每个拼块包含两个交叉结。Winfree利用2种tile(DAO和DAE)分别自组装形成了二维 DNA结构，这是最早形成大面积DNA二维结构的工作。之后也衍生出了各种类似的基于交叉结的拼接结构，如TX (Triple crossover)[6]、PX (Paranemic crossover)[7]等，并制备出了平面DNA阵列结构和DNA纳米管。同样是基于Hollidy交叉结Yan[8]则是在4个臂上都设计成Crossover，这样就形成了一种十字形的拼接单元，相对于前面的TX、PX等只能在两个平行方向进行扩展的结构，这种十字拼块可以在4个方向上进行延伸并保证足够的刚性。而 Mao[9]则借鉴了建筑工程学上的“张拉整体”(Tensegrity)这一概念，构建了一种更为稳固的三角拼接结构，每个角都是一个Holliday交叉结，而这一结构也被 Seeman[10]用在了构建三维DNA晶格上，并最终在2009年实现了他近30年的梦想。另外Mao[11-12]还进一步发展出了对称多角星结构，构建了微米尺度的网格阵列以及漂亮的多面体三维结构。最近Yin等[4]还构建了最大到60 MD的三维结构，并利用 TEM 和单分子超分辨光学成像得到了很漂亮的结果（如图1所示）。

图1 结构DNA自组装技术[2-4]Fig.1 Structural DNA self-assembly technology[2-4]

1.1.2 折纸DNA自组装

DNA折纸这一创造性的想法还应该源于 Shih等[13]在2004年的工作，他利用一条1.7 k nt的单链DNA结合5条短链构建了八面体结构。而在2006年 Rothemund[2]则进一步利用 M13噬菌体的长度7249 nt的基因组DNA作为主链，通过设计人工合成的 216条短链将其弯曲“折”成了各种二维结构（如图1所示）。需要注意的是，折纸结构中的每条短链长32 nt，每8 nt为一个单元，相邻的短链和主链间可以形成 Crossover结构，因此折纸结构的基本单元还是交叉结，这才能保证其具有足够的刚性。而我们课题组[14]也及时跟进做出了重要的贡献，设计构建了最早的非对称二维结构——中国地图。而三维 DNA折纸结构也很快在 2009年实现了。Andersen等[15]构建了一个正方体的空心盒子，并且利用链置换还可以控制其中一个盖子的打开闭合，很有趣的一个工作。Douglas等[16]则将一条DNA双螺旋视为一束，像堆电线杆一样将 DNA一条一条的堆积成了蜂窝状的实心结构，这个方法简直就是科学与艺术的完美结合，既具有科学的严谨性又包含艺术的美。Han等[17]则在2011年首次构建了曲面球体的三维折纸结构。本课题组也在发展一种构建更大尺寸折纸结构的方法[18]。

另外一种所谓的单链砖块自组装一直是Yin组发展的，其基本单元就是分成4个部分的42-nt单链DNA，将这些设计好的单链选择性的混在一起进一步自组装。Yin等[19]在2008年构建了一维纳米管结构，2012年构建了二维拼画图形和三维“乐高积木”结构（如图 1所示）[3,20]。从实验设计上来说，具有的创新点：想法比较简单，42-nt作为基本单元，可以利用 DNA的简单线性杂交形成各种不用形状的结构；具有折纸拥有但拼块自组装所不具有的优点：非周期排布，可用于进一步修饰的位点与42-nt链有关，“像素”高；DNA短链不需要很精确的定量，不需要很严格的序列设计。这种设计方法存在的一个缺点也很明显：如果想要得到更大的结构，就需要利用更多的短链，设计复杂度和合成成本都会大大增加。另外这一设计中没有完整的crossover结构，这应该是与传统意义上拼接和折纸等自组装技术最大的不同。

1.2 动态DNA自组装技术

利用 DNA的序列设计和对环境的改变可以实现人为控制在纳米尺度上 DNA不同结构或构象转换，这就是动态 DNA纳米技术的研究领域。根据转换的机制可以分成两类：环境改变驱动和链置换驱动的DNA纳米技术。

1.2.1 环境驱动DNA自组装

图2 动态DNA自组装技术[21-22]Fig.2 Dynamic DNA self-assembly technology[21-22]

1999年Mao等[23]利用B-DNA和Z-DNA在不同溶液缓冲条件下的构型转换实现了最早的动态DNA机器，在一般溶液缓冲环境中（中性 pH），DNA双链结构表现为正常的B型构象；通过人为改变溶液缓冲条件，DNA构型会转变为 Z型（左手螺旋）。Liu等[24]则利用一种特殊的DNA四链结构i-motif在不同pH值缓冲条件下的构型的改变实现了一种DNA分子马达。其机理利用了i-motif结构在弱酸性(pH<6.3)的条件下才能够稳定存在，而当人为改变至碱性或中性环境时就会解链成单链结构。

1.2.2 链置换驱动DNA自组装

DNA链置换反应是在恒温条件下，利用包含一段Toehold单链区的引发链部分互补的双链结构逐渐取代形成新的更为匹配的双链结构的过程。最早利用这一原理实现动态分子机器的是Yurke等[25]，他们将有互补区域的3条单链DNA构成一个DNA镊子，以 DNA作为“燃料”通过链置换反应驱动DNA镊子的打开和闭合。同样利用链置换，Gu[21,26]和 Bath[27]等还发展了另一种分子机器——DNA walker，Qian等[22]则实现了可以进行运算的 DNA逻辑门（如图2所示）。

2 电离辐射引起的DNA分子损伤

温度在绝对温度零度以上的自然界中的一切物体都以电磁波的形式时刻不断地向外传送能量，这种现象就是辐射(Radiation)。辐射是对等的，不论物体温度高低都向各个方向直线辐射。一般可按照能量的高低和电离物质的能力分为电离辐射和非电离辐射，电离辐射(Ionizing radiation)是频率高、波长短和能量高的射线，以粒子或波的双重形式释放出来。电离辐射有足够的能量从原子或分子的电离过程中释放出至少一个电子，而非电离辐射则无法达到。根据辐射的形式，可以将电离辐射主要分为α-射线、β-射线、γ-射线和 X-射线辐射等。

α粒子就是氦核(氦-4核)，由2个中子和2个质子构成。α-射线是一种带电粒子流，由于带电与物质会有强烈作用，因此所到之处很容易引起电离。由于α粒子的质量较大，一般衰变的α-射线无法穿透皮肤，因而不会伤及底下的组织。但是放射性同位素的α-射线很危险，当距离较近时容易损害人体组织细胞。α-射线对细胞造成的损害程度强于 γ-射线和X-射线。β-射线是高速带电的电子，其电离本领比 α-射线弱，但穿透能力比α-射线强，但与 X、γ-射线比，β-射线的射程短，很容易被铝箔、有机玻璃等材料吸收。X-射线和γ-射线的性质大致相同，是不带电波长短的电磁波，具有波粒二象性。两者的穿透力都极强，需要特别注意照射防护。X-射线是波长在0.01nm到10nm范围的电磁波，是由高能电子加速产生的。一般较重的原子吸收X-射线的几率更大，人体软组织由较轻原子构成而骨骼则由较重原子构成，骨骼相对于软组织更容易吸收更多的X-射线，因而被应用于医学诊断。γ-射线产生于原子核衰变，具有较高的能量。

DNA是电离辐射作用的靶分子，电离辐射通过对生物大分子的直接作用或间接作用导致各种类型的DNA损伤。

2.1 DNA分子损伤

2.1.1 改变DNA碱基序列

电离辐射会对 DNA分子造成碱基环破坏、碱基脱落丢失、碱基替代、形成嘧啶二聚体等损伤性破坏。4种碱基辐射敏感性依次为T＞C＞A＞G[28]。

2.1.2 DNA分子链断裂[29]

这是电离辐射损伤的主要形式，磷酸二酯键的断裂、碱基破坏或脱落和脱氧核糖分子破坏等都可以引起 DNA链断裂。双链中一条链断裂称单链断裂，两条链在同一处或相邻处断裂称双链断裂，双链断裂常并发氢键断裂，并且双链断裂难以修复，是细胞死亡的重要原因。

2.1.3 DNA分子交联

DNA分子受损伤后，在碱基之间或碱基与蛋白质之间形成了共价键，而发生 DNA-DNA交联和DNA-蛋白质交联[30]。嘧啶二聚体即是一种链内交联，还可发生链间交联。

2.2 DNA合成抑制

DNA合成抑制是一个非常敏感的辐射生物效应指标，受0.01 Gy照射即可观察到抑制现象[30]。照射后DNA合成抑制与合成DNA所需的4种脱氧核苷酸形成障碍、酶活力受抑制、DNA模板损伤、启动和调控 DNA合成的复制子减少，以及能量供应障碍等都有关。

2.3 DNA分解增强

在DNA合成抑制的同时，分解代谢明显增强。原因可能是辐射破坏了溶酶体和细胞核的膜结构，DNase释放直接与DNA接触，增加了DNA的降解。在一定剂量范围内，降解的程度决定于吸收剂量。照射后DNA代谢产物尿中排出量明显增多[31]。

电离辐射会对生物体产生一定的生物学影响，如电离辐射引起的二次肿瘤、退行性病变等[32-33]；在个体发育中造成的致畸作用[34]；引起细胞的坏死、凋亡、衰老等[35]。目前普遍认为，电离辐射产生作用的靶目标是细胞中的遗传物质DNA。电离辐射引起的 DNA损伤修复及其相关信号通路也一直都是放射生物学所关注的热点之一。

张梦达等[36]研究了心脏介入中的电离辐射对患者外周血淋巴细胞 DNA损伤的影响。他们依据介入术式的不同将100例心脏介入诊疗的患者分为4组：经皮冠脉介入术组、经皮冠脉造影术组、射频消融术组和永久性心脏起搏器植入术组。通过评估电离辐射对各组患者 DNA损伤的影响，研究结果显示不同的介入术式，术中的电离辐射均会造成患者DNA的损伤，辐射剂量越大，DNA损伤越严重。Zhou等[37]利用真核细胞内唯一的核外遗传物质线粒体DNA作为研究对象，使用长片段PCR对电离辐射引起的线粒体 DNA损伤进行了检测，这种方法准确反映了电离辐射引起的线粒体 DNA损伤的剂量依赖性，并对DNA构象的改变进行了检测。研究发现电离辐射能够引起显著的线粒体 DNA超螺旋构象的变化。Zhou等[38]还对电离辐射引起的线粒体 DNA区域性损伤进行了全面解析，发现这种损伤存在非随机性。研究结果显示线粒体 DNA控制区序列对电离辐射最为敏感，而编码区的损伤则较小。为进一步阐明其内在机理，Zhou等对线粒体DNA的序列结构进行分析，研究结果发现GGG元件在在变温动物线粒体 DNA控制区中含量很低，而在恒温动物中富集。肖汉方等[39]研究了血型糖蛋白A基因突变频率用于评价辐射危险和预测辐射诱发肿瘤的可行性。他们通过对放射诊疗工作人员的样品的研究，分析血型糖蛋白A基因突变频率并检测 DNA损伤修复能力。其结果显示，介入放射学组的血型糖蛋白A NO基因突变频率明显高于X-射线影像诊断组。研究表明对于电离辐射低剂量的人群，血型糖蛋白ANO基因突变频率可以反映DNA损伤效应。李宏阁等[40]研究了在心血管疾病中介入诊疗X-射线对人体DNA的影响。他们通过比较经皮冠状动脉造影术组、经皮冠状动脉介入术组以及射频消融术组3组患者的辐射面积剂量乘积、介入参考点累积皮肤表面入射剂量、透视时间以及患者介入手术前后染色体微核率变化情况。研究结果表明患者在接受不同的介入方法治疗后，均会引起不同程度X-射线辐射导致的DNA损伤。杨杰等[41]通过 Overlap PCR、酶切扩增和自杀质粒空载体并连接构建重组载体，将重组子转化大肠杆菌JM109感受态，并进行测序鉴定。他们成功构建了pprM DNA结合域基因敲除重组体，研究结果显示pprM DNA结合域与耐辐射奇球菌抗辐射功能相关。樊嵘等[42]利用siRNA和Tip60乙酰转移酶抑制剂抑制Tip60的表达或乙酰转移酶的活性，分析了细胞对γ-射线的敏感性并检测了DNA损伤修复。研究发现经γ-射线照射后，Tip60失活导致DNA双链断裂的修复能力降低。细胞在受到 γ-射线辐射损伤后，Tip60与DNA修复蛋白会发生相互作用，Tip60乙酰转移酶抑制剂能抑制DNA修复蛋白的T2609位点的磷酸化。研究表明Tip60通过与DNA修复蛋白的相互作用，能够影响细胞对γ-射线辐射的敏感性。

3 DNA自组装技术在电离辐射检测中的应用

DNA自组装结构具有结构的可设计性、高灵敏度及易得到性，现已广泛应用于生物医学领域。DNA本身对外显示电负性，因此其很难穿过与其同样带有负电荷的细胞膜。研究中一般会利用阳离子聚合物等用来补偿电荷因素的限制从而达到有效的细胞摄取率。然而研究发现，与这些简单的 DNA链不同的是，DNA纳米结构却能够容易地通过细胞膜，从而为其作为转运装置提供了可能。细胞摄取物的形状和大小会影响细胞摄取途径[43-44]。DNA纳米结构可以人工设计和构建，这为我们运用多种结构用于药物运输提供了可能。通过共价连接、核酸碱基配对、生物素-抗生物素反应、嵌入、核酸适体-配体反应和DNA-蛋白反应等方法可以将各种功能分子与DNA偶联[45-46]。由于DNA纳米结构可精确设计性及可寻址性，我们可以调控载带药物分子的个数及位置，而这种设计上的控制性是其他无机和有机纳米材料不可能实现的。例如，在 DNA纳米结构中设计某一位点作生物素标记，这样就可以控制链霉亲和素在该位点的标记[45-48]。核酸适配体是人工筛选的寡聚核苷酸，与特定的目标物存在高的亲和力。由于其高特异性和合成的简洁性，其在生物传感和医学诊断中有着广泛的应用[49]。多肽和蛋白很容易通过EDC/NHS反应、“Click”化学反应、生物素-抗生物素(biotin-avidin)链接、核酸适体-配体反应或者DNA-蛋白反应这些途径，与DNA纳米结构进行偶联[50-54]。最近，出现了许多在 DNA纳米结构的特定位置上锚定不同蛋白，用于阵列设计和

生物传感用途的工作[47,50,52-53,55-58]。

而利用电离辐射对DNA分子产生影响的性质，可以通过结合 DNA自组装结构来构建超灵敏辐射传感器。2011年3月的日本福岛核事故的发生使得发展监测α放射性核素的灵敏传感器更为迫在眉睫。α粒子，由氦原子核组成，由锕系元素的各种同位素，包括钍、铀、镎、钚、镅和锔发出。这些粒子较重，与其他常见的核辐射相比带有更多的电荷。因此，α粒子具有很高的线性能量转移值，并且很容易释放自己的能量，经过这一过程，其就可以消失，避免像其他放射物那样可能在与放射源合适的距离下就会被检测到。因此，实时在线监测核电设备的α辐射对于传统的检测器来说是个很大的挑战。半导体硅二极管和金属氧化物半导体场效应晶体管的剂量计都能够提供时间分辨数据[60]。两者都非常敏感，并具有良好的分辨率，但其响应会随有限的寿命而退化。它们需要电源单元和数据存储，不适合用于在线定量检测。尽管电离室在附近能轻松找到，还需要一个高电压储存设施，也太大而无法用于在线监测[61]。固体核径迹探测器提供了另外一种监测α粒子的技术，因为它们会沿其轨道产生原子位移和分子重排导致圆柱状小径[62]。虽然这种技术简单，灵敏，但它涉及到一个耗时的化学处理，并只允许离线监测，因而他在需要迅速做出反应的任何紧急情况就会失效。不可预测的核事故给科学家和工程师们发明一种灵敏的探测器，尤其是探测 α辐射提出了巨大挑战。由于本身具有很高的线性能量转移值，探测这种辐射的传感器需要置于和辐射源距离很近的地方。Dugasani等[59]报道了一种人工合成的DNA薄膜置于α辐射辐照后的表面形貌和光学响应的变化，并用原子力显微镜，拉曼图谱及反射显微镜对其进行了表征（如图3所示）。

另外还探讨了 DNA薄膜作为一种辐射传感材料的可能性。α辐照对 DNA薄膜的影响通过其与241 Am辐射源的距离及辐照时间来进行评估。DNA薄膜反射强度的明显变化表明，生物大分子构成的薄膜有望开发为实时监测辐射的传感器。研究了DNA二维薄膜结构在α粒子辐照下，利用AFM和拉曼光谱观察 DNA二维薄膜的构型变化，利用光学探测器和在线光谱测量了 DNA薄膜的光学反射强度的变化。单个α粒子的能量是7.2×10-13J，这足以破坏 DXL单元（DXL内氢键的能量是6.1×10-18J。利用生物分子来构建高效的辐射传感器是生物纳米技术研究的一个重要方向。

除了核武器产生的余波，主要的人为来源的电离辐射有核反应堆、核燃料循环设施、加速器，工业造影，辐射处理单元与核医学（诊断和治疗用途）。剂量深度为厚度的函数应该为理想地矩形形状，具有平坦的最大值和快速消失的后缘。该剂量是由不同的代码计算得到，并使用基于热释光剂量计(TLD)或光刺激发光剂量计(OSLD)的固态剂量计进行验证。很有必要设计一种传感器，能够相应更低的剂量(< 10 μSv)。由于治疗所用的辐射不可避免的是基于β粒子，其线性能量转移值远低于α粒子，越来越需要发展一种高效的超灵敏的辐射探测器来监测人们在核医学治疗过程中的所受的是辐射剂量，这些辐射大部分是基于放射性药物，尤其是β发射源。基于生物材料能够检测特定靶向材料或位点的传感器应用到纳米生物领域。

Dugasani等[63]利用人工设计合成的生长在基底上的DNA二维晶格材料，将它暴露于纯β发射源90Sr-90Y后进行了分析（如图4所示）。

图3 纳米DNA自组装薄膜构建α粒子辐照传感器[59]Fig.3 Nanometric DNA thin film as a sensor for alpha radiation[59]

图4 二维DNA自组装薄膜构建高灵敏β粒子辐照检测器[63]Fig.4 2D DNA lattice as an ultrasensitive detector for beta radiation[63]

在研究中使用的β辐射源是90Sr，它与90Y长期平衡。由于结构的可设计性，高灵敏度及易得到性，生物大分子，特别是 DNA分子很适合作为 β离子的探测平台。β辐照对DNA单分子层的影响是受计量调控的，在一定剂量下，主要依赖于以下两个物理参数：辐射源与 DNA晶格的距离以及辐照曝光时间。由于大量β离子的穿透，使得DNA晶格发生变形，减弱了它和基底的粘附。DNA膜的损伤程度是吸收的能量（剂量）的函数，并且它是独立的辐射性质。因此，很难对两个独立的辐射进行比较，主要有以下原因：(1)90Sr-90Y(β)的强度来源是 3.804 kBq，而对于241Am(α)是 729 Bq。(2)90Sr-90Y发出的辐射平均能量为0.471 MeV，而对于241Am是5.48 MeV。(3)β射线的线性能量转移值小得多，并且一个给定的介质（几米在空气中）的范围相比于α辐射的对应的值（～4.5 cm）大得多。由于辐射源强度和线性的能量转移值的差别，将 DNA晶格与辐射源的最佳距离保持为4-7 cm。他们研究了其拉曼图谱，以及在与辐照源不同距离和辐照时间下DNA晶格的反射程度。虽然β离子的线性能量转移值很小，仅有0.6nm厚的DNA膜在此条件下发生显著的物理化学变化，也证明了利用 DNA开发超灵敏β辐射探测器的可行性。利用SAG方法制备了生长在玻璃基底上的 DX DNA 二维晶格。将其暴露在β粒子下，调节距离和辐照时间，DNA二维晶格形貌，拉曼谱图及光学反射强度都有了明显变化。放置与于β相距4 cm处辐照10 min后，其拉曼峰值下降了约10倍。研究认为它原子力显微镜形貌，拉曼光谱，和反射率的变化与β辐照剂量/剂相关，这为发展一种灵敏的检测工具提供了基本支持，这种检测器有望应用到纳米技术、生物技术和医药中，甚至更传统的学科，如物理学、化学和生物学的研究。

DNA自组装技术在近30年来发展迅速，是可以用作研究单分子生物物理学的工具，同样广泛应用于生物医学传感、成像、诊断和载药，纳米孔测序和纳米光/电子学等领域。而利用电离辐射对DNA分子的损坏影响，最近又出现了利用DNA自组装纳米结构应用于电离辐射检测的研究。随着DNA自组装技术的发展，将会构建更复杂多功能的DNA纳米结构，广泛而深入地应用于各个领域，促进相关科学与技术的发展。

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