饲料中铜暴露对吉富罗非鱼幼鱼血红细胞微核和组织中铜蓄积的影响

王文龙，崔 欣，李成成，邢 星，安立龙,，许英梅

1. 广东海洋大学 动物科学系, 湛江 5240882. 钦州保税港出入境检验检疫局, 钦州 535008

饲料中铜暴露对吉富罗非鱼幼鱼血红细胞微核和组织中铜蓄积的影响

王文龙1，崔 欣1，李成成1，邢 星2，安立龙1,*，许英梅1

1. 广东海洋大学 动物科学系, 湛江 5240882. 钦州保税港出入境检验检疫局, 钦州 535008

为了研究饲料中铜暴露对吉富罗非鱼幼鱼的毒性作用，将1 080条罗非鱼幼鱼暴露于6个浓度梯度的高铜日粮中，通过60 d的暴露试验，测定罗非鱼血红细胞微核变化和组织中铜的蓄积。结果表明，铜在各组织中积累量的顺序依次为：肝脏>脾脏>肠道>鳃>肌肉，与对照组相比，其中肝脏、脾脏、肠道中铜的含量随着时间和日粮中铜浓度的升高而逐渐升高，而鳃和肌肉中铜含量无显著差异；罗非鱼幼鱼血红细胞微核率、核异常率、总核异常率与日粮中铜的浓度存在一定的剂量—效应关系，并且核异常率高于微核率。

铜暴露；蓄积；组织；血红细胞；微核率；吉富罗非鱼

罗非鱼是世界性的主要养殖鱼类之一，隶属于鲈形目、丽鱼科、罗非鱼属，是一种淡咸水两栖性的中小型鱼类，具有生长繁育快，产量高，食性杂，抗性强，肉质好等优点，深受养殖户和消费者的喜爱。广东省凭借其优越的地理和气候条件，是我国养殖罗非鱼最早的省份，也是我国最大和产量最高的罗非鱼产地。2009年，广东罗非鱼产量已达全国总产量的47%，约为59万t，2010年产量达到60万t，并呈现逐年增长的态势[1]，2012年广东出口的罗非鱼高居全国第一，并在北美占有相当高的市场份额[2]。但随着社会工业化进程的加快，作为改革开放最前沿的广东省所承受的重金属污染也越发严重，直接威胁罗非鱼等经济水生生物的安全和产品品质，影响其养殖和出口。近年来，重金属污染对生物体的毒性作用成为新的研究热点。

铜(copper)是生物体必须的微量元素之一，也是主要的重金属之一，过量的铜会产生毒性效应[3]，对生物体机体造成严重损害，与此同时，铜在水生生物体内的蓄积更是带来了不容忽视的食品安全隐患[4]，引发人们的广泛关注。目前关于饲料中高铜胁迫对畜禽的毒性作用的报道比较多，但饲料中铜暴露对鱼类的毒性研究很少，未见饲料中铜暴露对罗非鱼组织蓄积和遗传毒性的报道，少数的相关研究仅限于对铜最适添加量的探索，但实际上鱼饲料中铜的添加量往往大于其实际需要量，在不同条件下的需要量也不尽相同[5]，本文以饲喂铜暴露饲料的吉富罗非鱼幼鱼为模型，研究饲料中过量铜对罗非鱼的毒性作用，探究饲料中铜暴露对吉富罗非鱼幼鱼血红细胞微核以及组织中铜的蓄积的影响。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验动物与材料

试验鱼由广东省吴川国联罗非鱼良种场提供，试验前用药浴消毒，用对照组饲料驯养15 d，使其适应试验环境及试验饲料，选择健康无病、活跃灵敏的个体作为试验用鱼；试验中铜以CuSO4·5H2O(分析纯，上海易蒙斯化工科技有限公司)形式添加。

1.2 试验饲料

以鱼粉、豆粕、玉米粉、面粉、磷酸二氢钙、豆油、胆碱、食盐、预混料为基础饲料，所有原料经粉碎后过60目筛后混匀，采用逐级扩大法混合，日粮中设计铜的添加梯度为：0 mg·kg-1、3 mg·kg-1、30 mg·kg-1、300 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1、3 000 mg·kg-16个水平，试验基础日粮及营养组成见表1。

表1 试验基础日粮及营养成分(饲喂基础)Table 1 Ingredients and nutrient composition of basal diet(fed-basis)

注：*每千克预混料含VA 350 000 IU、VD3100 000 IU、VE 4 000 mg、VK3250 mg、VB1400 mg、VB21 500 mg、VB6600 mg、VB122.5 mg、D-泛酸钙2 000 mg、烟酰胺2 500 mg、叶酸250 mg、D-生物素5 mg、肌醇7 000 mg、VC 6300 mg、锌2 250 mg、锰1 200 mg、铁6 500 mg、钴120 mg、碘120 mg、硒25 mg。

Note： *Each kilogram of premix provided：VA 350 000 IU、VD3100 000 IU、VE 4 000 mg、VK3250 mg、VB1400 mg、VB21 500 mg、VB6600 mg、VB122.5 mg、calcium d-pantothenate 2 000 mg、nicotinamide 2 500 mg、folic acid 250 mg、biotin 5 mg、Inositol 7 000 mg、VC 6300 mg、Zn 2 250 mg、Mn 1 200 mg、Fe 6 500 mg、Co 120 mg、I 120 mg、Se 25 mg.

1.3 试验分组与饲养管理

选取健康无病的罗非鱼1 080尾，将其分为6组(见表2)，每组3个重复，每个重复60尾，饲养在规格为500 L的玻璃钢鱼缸中。空气压缩机24 h增氧，每3 d换水1/2缸，每天上午9点和下午6点投放两次相应组别的饲料，日投料量为鱼体重的3%(每10 d测一次鱼的平均体重，及时调整日投料量)，30 min后将剩余饵料吸出，烘干称重，每天观察记录水温、罗非鱼摄食和死亡情况。

1.4 样品采集与指标测定

试验第20天、40天、60天各分别取样一次，取样前饥饿24 h，每次每个重复分别取12条罗非鱼，其中取4尾进行尾静脉采血，微核试验的测定参见何理平等[8]的方法；剩余8尾采用捣毁脑髓法将鱼处死，取出肌肉、鳃、脾脏、肝脏、空全肠，用0.65%的

表2 试验分组Table 2 Design of groups

生理盐水漂洗并滤干，取样品加硝酸和高氯酸湿消解，用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS，美国安捷伦科技有限公司)测定样品中铜的含量。

1.5 数据处理

采用SPSS 20.0软件对试验数据进行单因素方差分析，采用Duncan’s法多重比较差异的显著性，差异显著定义为P<0.05，数据采用“平均数±标准差”来表示。

2 结 果(Results)

2.1 饲料铜暴露对吉富罗非鱼血红细胞微核的影响

20 d时，对照组和第Ⅰ组没有微核，而其余各组间无显著差异(p>0.05)，微核率最高是第Ⅴ组，为(0.32±0.02)‰。核异常率随着日粮中铜含量的升高逐渐升高，其中最高为第Ⅴ组(1.09±0.05)‰。总核异常率也随铜含量的升高逐渐升高，第Ⅳ组和第Ⅴ组的总核异常率分别为(1.13±0.04)‰和(1.41±0.03)‰，显著高于其它组(p<0.05)，而其它组间无显著差异(p>0.05)。

40 d时，第Ⅳ组和第Ⅴ组的微核率显著高于对照组(p<0.05)，前三组与对照组无显著差异(p>0.05)。核异常率随着铜含量的升高而有不同程度的上升，第Ⅳ组和第Ⅴ组的核异常率显著高于对照组(p<0.05)，分别为(1.20±0.02)‰和(1.27±0.05)‰。高剂量组的总核异常率上升的幅度大于低剂量组，第Ⅴ组总核异常率最高(1.66±0.04)‰，与对照组相比升高1.43‰。

表3 铜对罗非鱼血红细胞微核的影响Table 3 Effects of dietary copper on micronucleus in erythrocytes of tilapia

注：同列小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，同行肩标中大写字母完全不同表示差异显著(p<0.05)，有相同字母或无字母表示差异不显著(p>0.05)，大小写字母间不比较。下表同。

Note: In the same column, values with different lowercase superscripts mean significant difference(p<0.05). In the same row, values with different uppercase superscripts mean significant difference(p<0.05). While with the same letter or no letter mean no significant difference(p>0.05), and there is no contrast between lowercase and uppercase. The same below.

60 d时，第Ⅳ组的微核率最高，为(0.57±0.03)‰，第Ⅴ组略低于第Ⅳ组，为(0.48±0.01)‰，两者间无显著差异(p>0.05)，但都显著高于对照组。核异常率随着铜含量的升高有逐渐升高的趋势，第Ⅴ组最高(1.34±0.04)‰。总核异常率是第Ⅴ组最高，相比对照组升高1.61‰，比第Ⅳ组高0.07‰，各组间差异显著(p<0.05)。

随着日粮中铜暴露时间的延长，同一组微核率、核异常率和总核异常率均有不同程度的升高。前40 d，第Ⅳ组和第Ⅴ组核异常率升高幅度较大，而前三组的微核率变化不明显。说明随着日粮铜暴露时间的延长和铜含量的升高，罗非鱼血细胞损伤加重。2.2 饲料铜暴露对吉富罗非鱼组织中铜蓄积的影响

2.2.1 饲料铜暴露对吉富罗非鱼腮中铜蓄积的影响

由表4可以看出，在第40天和60天时，各组间鳃中铜的含量随着日粮中铜浓度的升高有增加的趋势，第60天时，第Ⅴ组鳃中铜的含量达到最高，为3.16±0.51 mg·kg-1。随着铜暴露时间的延长，铜在鳃中的积累无显著变化。其中第Ⅲ组和第Ⅳ组鳃中铜的含量在第40天时达到最高，分别为3.10±0.29 mg·kg-1和2.87±0.47 mg·kg-1，对照组、Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅴ组均在第60天时达到最高。说明日粮中铜暴露对罗非鱼鳃中的铜的积累无显著影响，但随着添加铜暴露时间的延长有升高的趋势。 2.2.2 饲料铜暴露对吉富罗非鱼脾脏中铜蓄积的影响

由表5可以看出，在第20天时，各组脾脏中铜含量无显著差异，但第Ⅴ组含量最高12.20±0.24 mg·kg-1。第40天时，对照组与第Ⅰ组无显著差异，第Ⅱ组脾脏中铜含量为20.16±0.23 mg·kg-1，较对照组显著升高(P<0.05)，第Ⅴ组最高，为29.54±0.52 mg·kg-1，Ⅳ组和Ⅴ组间无显著差异(P>0.05)。第60天时，随着日粮中铜浓度的升高各组脾脏中铜的积累量也随之升高，且差异显著(P<0.05)，第Ⅴ组达到最高，为45.76±3.13 mg·kg-1。

表4 铜在罗非鱼鳃中的积累Table 4 Copper accumulation in gill of tilapia

表5 铜在罗非鱼脾脏中的积累Table 5 Copper accumulation in spleen of tilapia

对照组脾脏中铜的积累随日粮中铜暴露时间的延长而有所增加，但不显著。第Ⅰ组肠道中铜的含量在第20天和第40天时与开始时比较仍无显著变化，但到第60天时上升到18.74±0.23 mg·kg-1。Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组脾脏中铜的积累量在第40天和60天时都显著升高，第Ⅴ组升高的幅度最大，在第60天时为45.76±3.13 mg·kg-1。说明随着日粮中铜暴露时间的延长和日粮中铜浓度的升高，铜在罗非鱼脾脏中显著积累。

2.2.3 饲料铜暴露对吉富罗非鱼肝脏中铜蓄积的影响

如表6所示，随着饲料中铜的含量的升高各组肝脏中铜的积累量也随之增加，第Ⅴ组肝脏中铜含量最高，为63.23±3.14 mg·kg-1，与对照组相比显著升高(P<0.05)。第40天和60天时，各组肝脏中铜的含量均随着饲料中铜的升高而增加，且各组间差异显著(P<0.05)。

表6 铜在罗非鱼肝脏中的积累Table 6 Copper accumulation in liver of tilapia

随着铜暴露时间的延长，对照组肝脏中铜的含量无显著变化，但是其它组肝脏中铜的含量随之增加，而且差异显著(p<0.05)，以第Ⅴ组在60天时含量最高，为102.3±16.54 mg·kg-1。说明随着铜暴露时间的延长和日粮中铜浓度的升高，铜在罗非鱼肝脏中显著积累。2.2.4 饲料铜暴露对吉富罗非鱼肠道中铜蓄积的影响

由表7可知，第20天时，对照组与第Ⅰ组无显著差异，分别为3.17±0.15 mg·kg-1和3.16±0.41 mg·kg-1。之后随着日粮中铜的升高其它各组肠道中铜的含量逐渐增加。第40天时，第Ⅴ组肠道中铜的含量最高，为26.42±4.10 mg·kg-1，显著高于对照组(p<0.05)。第60天时，随着日粮中铜的升高，各组肠道中铜的积累也逐渐上升，第Ⅴ组肠道中铜含量最高，为48.61±6.13 mg·kg-1，较对照组显著升高(P<0.05)。

随着日粮中铜暴露时间的延长，对照组肠道中铜的积累量无显著影响(p>0.05)，其它各组肠道中铜的含量均随着暴露时间的延长而增加，第Ⅴ组肠道中铜含量在第20天时为11.24±1.82 mg·kg-1，而到第60天时升高到48.61±6.13 mg·kg-1。说明随着日粮中铜暴露时间的延长，高剂量的铜可在罗非鱼肠道中积累。2.2.5 饲料铜暴露对吉富罗非鱼肌肉中铜蓄积的影响由表8可知，第20天时，各组间肌肉中铜的积累并无显著差异(p>0.05)，第40天时，第Ⅳ组和第Ⅴ组肌肉中铜的积累分别为2.29±0.02 mg·kg-1和2.42±0.10 mg·kg-1，显著高于对照组(p<0.05)。第60天时，第Ⅴ组达到最高为3.10±0.13 mg·kg-1。

对照组、第Ⅰ组、第Ⅱ组肌肉中铜的含量随着日粮中铜暴露时间的延长无显著变化，基本上呈现出先升高再降低再升高的趋势，而Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组肌肉中铜的积累都随着暴露时间的延长而有不同程度的增加，说明高剂量的铜随着添加铜暴露时间的延长可在罗非鱼肌肉中慢慢积累。

表7 铜在罗非鱼肠道中的积累 Table 7 Copper accumulation in intestine of tilapia

表8 铜在罗非鱼肌肉中的积累Table 8 Copper accumulation in muscle of tilapia

3 讨 论(Discussion)

3.1 饲料铜暴露对吉富罗非鱼血红细胞微核的影响

微核实验是用来检测动物细胞受外界有害物质损害程度的一种方法，该方法快速、简单、有效，由Matter和Schmide在20世纪70年代初建立的[9]。微核是指在胞浆中独立于主核的核小体，它的染色比主核淡，直径一般在主核的1/4以下。它的形成主要是因为受到外界有害因素的影响，在细胞分裂后期时，无着丝点的染色体断裂产生的断片或者染色体落后而没有进入子代细胞的细胞核里，滞留在间期的子代细胞浆内形成微核[10]。

在本实验中，各组间随着日粮中铜含量的增加，微核率、核异常率、总核异常率均有不同程度的升高，对照组与第Ⅰ组、第Ⅱ组间无显著差异，而第Ⅳ组和第Ⅴ组显著高于对照组。这说明高剂量的铜会对罗非鱼造成一定的损害。这与王利等的研究结果一致。而薛良义等[11]报道，随着水中铜浓度的升高，黄鳝细胞微核率开始上升，到12 h以后又下降，说明黄鳝在12 h以后对有害物质产生抵抗力，抑制了微核的产生。可能不同种类的鱼对有害物质的反应存在差异，且与染毒时间的长短有关。

在本研究中，核异常率比微核率高，可能是因为微核率的高低不仅与有害物质或纺锤体抑制剂的强弱有关，而且还与细胞有丝分裂的速度有关。而且微核率与核异常率出现的最高值也不一致，第Ⅳ组的微核率在第60天时达到最高，而核异常率在第40天最高。在第40天和60天时，微核率都是第Ⅳ组最高，而核异常率是第Ⅴ组最高，这可能是高铜诱发罗非鱼红细胞微核和核异常的作用机理不同，铜抑制罗非鱼的纺锤体行成而产生核异常，使微小核物质滞留在质核外的时间、程度不一致，同时也表明细胞内产生微核与核异常的时间并不完全同步。

3.2 饲料铜暴露对吉富罗非鱼不同组织中铜蓄积的影响

我国《农产品安全质量—无公害水产品安全要求》[12]和《无公害食品—水产品中有毒有害物质限量》[13]中规定，水产品中铜的含量不能超过50 mg·kg-1。本试验中，在养殖第20天时，第Ⅴ组中肝脏的铜含量已经达到63.23 mg·kg-1。到第40天时，第Ⅳ组中肝脏铜含量为56.52 mg·kg-1，第Ⅴ组肝脏铜含量达到98.64 mg·kg-1。养殖到60天时，第Ⅲ、第Ⅳ和第Ⅴ组肝脏中铜的含量分别达到60.19 mg·kg-1、89.80 mg·kg-1、102.30 mg·kg-1。因此，肝脏中铜的含量都已经超过我国对水产品中铜含量的限定。说明饲料中铜含量为3 086.76 mg·kg-1时，对罗非鱼肝脏已经造成威胁，应禁止添加如此高的铜。日粮中铜含量分别为334.47 mg·kg-1和1 057.29 mg·kg-1时，分别在第60天和40天时，肝脏中铜含量也超过国家限定，因此也应该减少铜的添加量。在其它组织内铜的含量均低于国家限定标准，但在试验结束时，第Ⅴ组脾脏和肠道中铜的含量已经达到45.26 mg·kg-1和48.61 mg·kg-1，接近国家的限定标准。而肌肉中铜的含量最少，且远远低于国家的限定标准，这对食品安全来说还是很有利的。

李湘萍等[14]研究了铜在养殖对虾组织中的积累，发现铜在肝胰腺中的积累最高，在肌肉中的积累最低。马桂云等[15]报道了铜在鲫鱼体内的积累特征，同样发现，铜在各组织内的积累量具有很大差异，且内脏>鳃>肌肉。Paez等[16]、Pourang等[17]、Morales等[18]和贺亮等[19]也得出了相似的结论。这与本研究的结果一致，肝脏中铜的含量最高，且随着时间的延长和日粮中铜含量的升高显著增加，而肌肉中铜的含量最少，且各组间无显著差异。这可能是因为肌肉中的铜有自我平衡的调节能力，铜的沉积可以受到机体控制。而肝脏是主要的解毒器官，它可以过滤除去外来的有毒物质。因此，肝脏对铜具有很强的累积作用，肝脏中铜的含量可以作为评价铜状态的一个灵敏指标。

脾脏是鱼类的造血器官同时也是重要的免疫器官。在本实验中，铜在各组织中的蓄积由多到少依次为：肝脏>脾脏>肠道>鳃>肌肉，可见肝脏是动物存储铜的主要器官，积累最多，而铜在脾脏中积累的也比较高。在前期，各组的脾脏中铜的含量无显著差异，但在中后期脾脏中铜的含量随着日粮中铜的含量开始逐渐升高，且第Ⅴ组在试验结束时，铜含量达到45.26 mg·kg-1，已经接近我国水产品中对铜的限定标准。铜在脾脏中的大量积累可能会对罗非鱼的免疫功能造成一定影响。蒋蓉[20]在用不同水平铜的饲料投喂黄颡鱼后，也发现铜在肝脏、脾脏、脑和卵巢中的积累较多。Gretehen等[21]用铜含量为5、571、785、1 013 μg·g-1的饲料喂养杂交斑纹鲈14 d，发现肠和肝脏中铜含量最高达45 mg·kg-1和120 mg·kg-1左右。

本实验以吉富罗非鱼为研究对象，分别在饲料中添加0、3、30、300、1 000、3 000 mg·kg-1铜，研究了对其红细胞微核和与组织中铜的蓄积的影响，得出以下主要结论：1、铜在各组织中积累的顺序依次为：肝脏>脾脏>肠道>鳃>肌肉，其中肝脏、脾脏、肠道中铜的含量随着时间和日粮中铜的浓度的升高而逐渐升高，而鳃和肌肉中铜含量无显著差异；2、罗非鱼幼鱼血红细胞微核率、核异常率、总核异常率与日粮中铜的浓度具有一定的剂量—效应关系，且核异常率高于微核率。

致谢：感谢广东海洋大学动物科学系412实验室全体同仁，以及广东恒兴集团湛江恒兴水产科技有限公司、广东吴川国联罗非鱼良种场对本试验的支持和帮助。

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EffectsofDietaryCopperExposureonMicronucleusofErythrocyteandAccumulationinDifferentTissuesofJuvenileGIFTTilapia(Oreochromisniloticus)

Wang Wenlong1, Cui Xin1, Li Chengcheng1, Xing Xing2, An Lilong1,*, Xu Yingmei1

1. Department of Animal Science, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China2. Free Trade Port Aera Entry-Exit Inspection and Quarantine, Qinzhou 535008, China

15 May 2014accepted22 August 2014

In this study, the effects of dietary copper exposure on juvenile GIFT tilapia were investigated. 1 080 juvenile GIFT tilapia were exposed under 6 different concentrations of high-dose copper diets for 60 days. Micronucleus changes of erythrocyte and accumulations of copper in different tissues were observed. The results showed that accumulations of copper in different tissues were liver> spleen> intestine> gill> muscle. Among them, accumulations of copper in liver, spleen and intestine gradually increased with exposure time and copper accumulation in diets. And compared with control group, the difference was significant. However, the accumulations of copper in gill and muscle were not significant. There was a positive dose-effect relationship between micronucleus rate, frequency of nuclear anomalies, total frequency of nuclear anomalies of erythrocyte in juvenile GIFT tilapia and copper dose in diets. Moreover, the frequency of nuclear anomalies was higher than micronucleus rate.

copper exposure; accumulation; tissue; erythrocyte; micronucleus rate; GIFT tilapia

2014-05-15录用日期：2014-08-22

1673-5897(2014)4-757-08

： X171.5

： A

安立龙(1967-)，男，动物遗传育种学博士，教授，主要研究方向为动物营养与环境，发表相关学术论文80余篇。

广东省科技计划项目(2010B090400376)

王文龙(1989-)，男，硕士，研究方向为动物营养与环境，E-mail: wangwenlong2012@yeah.net；

*通讯作者(Corresponding author)，E-mail: anlilong@126.com

10. 7524/AJE. 1673-5897. 20140515017

王文龙，崔 欣，李成成, 等. 饲料中铜暴露对吉富罗非鱼幼鱼血红细胞微核和组织中铜蓄积的影响[J]. 生态毒理学报, 2014, 9(4): 757-764

Wang W L, Cui X, Li C C, et al. Effects of dietary copper exposure on micronucleus of erythrocyte and accumulation in different tissues of juvenile GIFT tilapia (Oreochromisniloticus) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(4): 757-764 (in Chinese)