雨养沼泽泥炭腐植酸的性质和结构

2014-09-25MarisKlavinsOskarsPurmalis

腐植酸 2014年4期

Maris Klavins，Oskars Purmalis 著

韩征2 赵红艳2* 译

(1 拉脱维亚大学环境科学系里加 LV1586 2 东北师范大学地理科学学院长春 130000)

腐植酸类物质是一类自然产生的复杂有机物，通常为黄色到黑色，分子量较高。腐植酸类物质可分为三部分：(a)任何pH值下都不溶于水的是腐黑物；(b)酸性条件下(pH值低于2)不溶、较高pH值(碱性)下可溶于水的是腐植酸(HA)；(c)任何pH条件下都可溶的是黄腐酸(FA)。腐植酸类物质是土壤、泥炭和自然水体中有机物的主要成分，它能影响化石燃料的形成过程，在全球碳的生物地球化学循环中贡献颇大。腐植酸类物质不仅对环境中某些元素和有机污染物的固定过程起着重要作用，还是一种重要资源。因此，对腐植酸性质的研究引起人们极大的兴趣。

腐植酸类物质来源不同，其结构和性质也不同。由于天然有机物(植物、动物和微生物)和腐殖化条件(形成年代、气候条件和其他因素)的差异，腐植酸性质与其来源的关系很难解释清楚。活有机体腐殖化过程非常复杂，其分解时环境条件差异较大，反应速度较慢，组成有机质的分子数量庞大且存在结构差异。可以推测，腐殖化条件(温度、氧化还原条件、pH值、矿化作用和其他因素)能够影响活有机体中间转换产物——腐植酸的结构和性质。因此，有必要研究相对均一稳定的雨养沼泽环境中活有机体的腐殖化过程。

泥炭是苔藓和其他成炭植物如莎草、灌木或树木等在水淹条件下，部分分解而形成的有机物料，一般呈浅棕色到黑色，是沼泽和湿地生态系统的重要组成部分。泥炭层能够记录过去的环境变化。泥炭中储存了丰富的有机碳，它在碳的生物地球化学循环和气候变化中起着重要作用。泥炭发育过程中，植被、温度、降水和相应的沼泽水文条件和湿地流域的土地利用也同时发生着变化，可以通过有机物岩化过程的微观特征来观察腐植酸性质的相应变化。然而，很少有研究涉及泥炭(特别是完整的泥炭剖面)性质与腐植酸性质之间的关系。

本文使用化学方法和光谱技术(元素和官能团分析、紫外光谱、荧光光谱、红外光谱、电子自旋共振(ESR)、核磁共振(13C NMR)、裂解-气相色谱/质谱)阐述雨养沼泽泥炭腐植酸的性质，评估腐植酸的均质性，并研究腐殖化度对腐植酸结构和性质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

质量分析试剂，均未经提纯处理。购自Merck公司、Sigma-Aldrich有限公司和Fluka Chemie公司，配制溶液用水为Millipore Elix 3超纯水，购自Millipore公司，使用总量为10～15 MΩ/cm。

1.2 泥炭采样及泥炭特征

泥炭样品取自 Eipurs、Dižpurvs和 Dzelve地区典型雨养沼泽，并被切割成层(表1)。样品在105 ℃干燥后，混匀过1 mm筛，用Carl-Zeiss双目显微镜观察，分析其植物残体组成及分解程度，并测量腐植酸和黄腐酸比值(HA/FA)。样品14C检测在爱沙尼亚塔林技术大学地质研究所完成。泥炭和腐植酸样品中C、H、N和S含量用裂解-气相色谱技术测定(EA-1108元素分析仪，Carlo Erba仪器)。利用灰分含量校正元素组成，O含量通过差分计算获得。

1.3 腐植酸的分离

取10 g风干泥炭与200 mL 0.1 mol/L盐酸反应1 h后，弃上清。添加100 mL水到沉淀物中，培养30 min，加入1 mol/L NaOH调节溶液pH值到7。然后，在N2环境下，添加1 mol NaOH直至液体总体积达到2 L，并不断搅拌。24 h后，通过玻璃棉过滤，用6 mol/L HCl调滤液pH值至1。将溶液静置，离心后弃上清。沉淀物(含有腐植酸)用蒸馏水反复洗涤、离心、弃上清。将离心后所得固体残渣搁置于0.1 mol/L HCl与0.3 mol/L HF混合物中，以去除矿物颗粒。重复操作，直到灰分含量低于2%。最后，通过透析膜去除氯化物(滤掉分子量小于3500 Da部分)，并排出水分，将上述处理得到的腐植酸冷冻干燥。

1.4 腐植酸的特征

1.4.1 元素组成

用裂解-气相色谱技术测定C、H、N和S含量。取样品50 mg，750 ℃加热8 h后，测定各泥炭灰分含量，利用灰分含量校正元素组成，O含量通过差分计算获得。用Van Krevelen图表统计方法对数据进行分析。

1.4.2 羧基和总酸度

用自动滴定仪TitroLine Easy(Schott-Geräte GmbH)测量各腐植酸样品羧基和酚的酸度。采用醋酸钙法，通过生成的乙酸来确定羧酸根的总数。称取20 mg腐植酸加入100 mL锥形瓶中，N2环境下加入10 mL 0.2 mol/L醋酸钙溶液。采用电位滴定法，用0.1 mol/L NaOH滴定，调节样品pH值至9。添加20 mg腐植酸至10 mL 0.1 mol/L Ba(OH)2溶液中，N2环境下震荡一夜后，过滤、洗涤，测定总酸。用0.1 mol/L HCl调节滤液和洗涤液pH值至8.4。

1.4.3 胶体稳定性试验

在凝固试验中，取0.2 g/L腐植酸，增加电解液中胶体数量(NaCl，直到浓度为1 mol/L)，pH值恒定为3。样品静置3天。采用HACH DR/2000分光光度计测定胶结强度，在450 nm处测定胶体浓度为0.0001 mol/L、0.01 mol/L、1 mol/L的浊度T0.0001、T0.01、T1。根据下式计算胶结率(T)。

1.4.4 腐植酸的疏水性

根据腐植酸在水和聚乙二醇(PEG 20000，Fluka)之间的分布情况，利用分配系数KPEG/W(类似于辛醇/水分配系数KOW)表示腐植酸的疏水性。

1.4.5 紫外-可见光谱和光谱比

用Thermospectronic Helios γ UV紫外分光光度计在直径为1 cm的二氧化硅试管中获取紫外-可见光谱，将10 mg 腐植酸溶于1000 mL 0.05 mol/L的NaOH溶液中，测定紫外-可见光谱比值E2/E3、E4/E6以及280 nm和360 nm、465 nm和665 nm处的吸光值比率。

1.4.6 荧光光谱

用0.5 mol/L HCL调节2.5 mg/L样品溶液pH值至7，用Perkin Elmer LS 55荧光光谱仪获得荧光光谱。控制激发波长为350 nm，记录发光光谱(波长380～650 nm，狭缝带宽10 nm，扫描速度500 nm/min)。

在激发波长为250～600 nm范围内，测定同步扫描荧光光谱，设置激发单色器和发射单色器带宽Δλ=18 nm，狭缝宽度5 nm。

1.4.7 红外光谱

用Perkin Elmer 400红外分光光度计记录4000～450 cm-1傅里叶变换红外(FTIR)光谱。取1 mg样品和400 mg溴化钾混合均匀，在干燥条件下制成KBr压片。

1.4.8 电子自旋共振谱

利用RE-1306光谱仪获得电子自旋共振谱(ESR)，频度为X波，磁场为100 kHz。

1.4.913C核磁共振光谱

1.4.10 裂解-气相色谱/质谱法

利用Frontier公司生产的双击裂解仪Py-2020iD(500 ℃，升温速率600 ℃/s)，与配有RTX-1701的岛津GC/MS-QP 2010直接耦合，记录裂解-气相色谱/质谱(Py-GC/MS)。用Library MS NIST 147.LI13识别单个化合物。对相关峰的总摩尔面积归一化处理至100%，取3次试验数据的平均值。

1.4.11 数据处理

利用统计软件SPSS 16进行数据分析。采用Kolmogorov-Smirnov检查试验数据与正态分布的对应关系，使用非参数方法做进一步分析。采用Spearman等级评估系数评估不同性质间的关系。所有情况下，显著性水平均为P=0.05。

2 结果与讨论

2.1 泥炭性质

从Eipurs、Dzelve、Dizpurvs 3个涵盖主要岩性类型的典型雨养沼泽泥炭取样，分别从不同泥炭层(深度)提取分离腐植酸，泥炭性质见表1。从表1可以看出，沼泽地表植被主要有锈色泥炭藓、中位泥炭藓、红肿泥炭藓等。泥炭剖面上部是已发育成的雨养沼泽，而底部是矿养沼泽。整个剖面以不同种类的水藓泥炭为主。泥炭分解度从10%到60%不等，样品14C年龄范围为距今不到100年到距今9000年之间。如果上层泥炭腐殖化程度较低，相应地，HA/FA小于10，如果腐殖化程度较高，那么这个比值就大于30。这表明，泥炭腐殖物质主要是由腐植酸决定的。本文选取HA/FA大于30、以腐植酸为主要组成的泥炭层作为研究对象。

表1 用于提取腐植酸的泥炭性质Tab.1 Properties of peat used for extraction of humic acid

元素组成(C、H、N、O、S)反映了泥炭的基本性质(表2)。本研究的泥炭灰分含量从1.11%到大于6%不等。C大约在40%～55%范围内，H和N分别在5.4%到6.2%、0.5%到大于2%之间变化，S介于0.3%～1.2%之间。Eipurs地区沼泽元素组成相对易变，并且反映了泥炭类型和分解程度。该沼泽剖面表层C含量高达53%，在泥炭上部和下部，N含量都较高，其增加值与泥炭组成和形成条件的变化有关。泥炭上层S含量明显较低，但在整个泥炭剖面中相对稳定。Dzelve地区沼泽泥炭组成则有很大不同，且在很大程度上反映了泥炭组成：表层C含量较低(大约为45%)，从剖面表层到距表层3.25 m深处含量相对均衡，随着深度增加，C含量迅速增加到55%，元素比值(O/C，H/C，N/C)也表现类似的变化。

2.2 泥炭腐植酸的基本性质

从不同的泥炭中分别分离出腐植酸，研究其元素组成。结果发现，泥炭中腐植酸的元素组成差异显著：C含量介于49%～57%之间，H、N、S以及灰分含量分别在4.6%～5.7%、1.6%～2.8%、0.5%～1.5%、0.1%～1.2%之间，根据质量平衡计算得出O含量为32%～42%(表3)，这可能是沼泽本身及取样间隔不同造成的。

表2 泥炭元素组成Tab.2 Peat elemental composition

表3 泥炭腐植酸元素组成Tab.3 Elemental composition of peat humic acids

一般情况下，随深度增加，C、H含量增加，N含量下降，而S变化无明显规律。根据Orlov观点，O/C，H/C和N/C可以鉴定不同环境中泥炭腐植酸类物质的结构变化和腐熟程度。Van Krevelen图解法是研究腐植酸及碳的生物地球化学循环的常用方法，本研究使用该方法进行泥炭腐植酸元素组成分析(图1)。图1可以反映成炭植物腐烂、腐植酸富集(易降解的化合物质量损失)直到形成煤的过程中，泥炭腐熟度和降解强度的变化，如脱氢(H/C降低)、脱羧(O/C降低)、去甲基化等。成炭植物(区域3)与高度分解的有机物(低位泥炭、煤)原子比(区域1)差异显著。泥炭的化学组成介于活有机体和煤之间(区域5)，当碳水化合物、氨基酸等分解后，芳烃和多环芳烃结构出现，腐植酸结构趋于形成。相比之下，泥炭仍处于成岩初期。羧基和酚羟基是泥炭腐植酸中主要官能团。与其他(水、土壤、沉积物)腐植酸类物质相比，泥炭腐植酸中羧基和酚羟基含量相对较低(表4)。泥炭剖面深度不同，羧基和酚羟基的含量也不同。3个剖面上部羧基含量很少，随泥炭深度和腐殖化程度增加，羧酸酸性增强。羧基含量与O/C显著相关，说明腐植酸中O多以羧基形式存在。在酸性环境中，由于离子强度发生了变化，腐植酸具有胶结能力。研究发现，腐植酸的胶结能力随泥炭深度增加而增大(表4)。胶结能力发生变化表明与腐植酸分子质量相应变化有关。

图1 腐殖化过程中活有机体元素组成变化Van Krevelen图Fig. 1 Van Krevelen graph of living organic matter elemental composition changes during humif i cation

表4 泥炭腐植酸的功能特性Tab. 4 Functional properties of peat humic acids

2.3 泥炭腐植酸的结构特征

腐植酸类物质的紫外光谱可以反映泥炭基本结构的重要信息。根据Dzelve沼泽不同深度泥炭腐植酸的紫外-可见光谱(图2)可以看出，泥炭腐植酸吸光值随着波长的增加逐渐减小(图2)。其中，表层泥炭腐植酸的吸光值在280 nm处略有上升。整个泥炭剖面的腐植酸光谱变化大致相似，只是光密度略有不同。用紫外吸光曲线可以用80 nm和360 nm(E2/E3)、465 nm和665 nm(E4/E6)紫外吸收率来衡量(表4)，这可能与芳香族化合物缩聚程度(芳香性)、粒径、分子量等有关。根据文献资料显示，底部泥炭(分解程度较高，年代久远)的E4/E6较高，说明芳香族化合物缩聚度低，粒径与分子量较大。

图2 Dzelve沼泽不同深度泥炭腐植酸的紫外-可见光谱Fig.2 UV-Vis spectra of peat humic acids from Dzelve Bog depending on the depth of the sample

泥炭腐植酸荧光发射光谱集中在以435 nm为中心420～520 nm之间(其激发波长为330 nm)。由图3可以看出，上层泥炭腐植酸光谱特征较为明显，底层泥炭腐植酸光谱则普遍在短波处升高。虽然荧光基团的确切性质还未阐明，以典型的土壤腐植酸类物质来看，长波处的光谱可能与被取代的至少携带一个供电原子团的芳香核和具有高度共振性的共轭不饱和系统有关。与水体腐植酸相比，泥炭腐植酸在短波处达到最大值，这表明芳香族缩聚程度和发色团共轭水平较低。木质类结构对泥炭腐植酸的荧光性似乎没有太大影响。

图3 Dzelve沼泽不同深度泥炭腐植酸荧光光谱Fig. 3 Fluorescence spectra of peat humic acids from Dzelve Bogdepending on the depth of the sample

与荧光发射光谱相比，同步扫描光谱(图4)能反映更多的信息，包括腐植酸的基本结构表征、区别和分类。整个泥炭层腐植酸光谱大致相同。表层中含有未分解物质，其光谱特征较为明显。280/298 nm强光谱可能与含有芳香酸或高度共轭脂类结构有关。330/340 nm和355/373 nm强光谱可能与被取代的芳族结构有关。460/478 nm强光谱可能与苔藓植物中存在荧光结构有关。

图4 Eipurs沼泽不同深度泥炭腐植酸同步扫描荧光光谱(△λ= 18 nm)Fig.4 Synchronous scanning fl uorescence spectra of peat humic acids from Eipurs Bog (△λ= 18 nm) depending on the depth of the sample

腐植酸红外光谱(图5)检测结果大致相似，某些波段吸收值的差异可能与样品来源和本质属性有关。根据其含有的主要官能团，可以将光谱分成几个区域。3600～2800 cm-1吸光值是由腐植酸和矿物成分中-OH决定。2920 cm-1和2860～2850 cm-1吸光值表明有CH3-和CH2-存在。红外光谱分析结果表明，-(CH2)n-以相对较短的烷烃链(n<4)存在。1700 cm-1(1725～1700 cm-1)吸光值表明有醛、酮、羧酸、羰基存在。最大吸光值主要取决于共轭程度高低以及取代基和氢键是否存在。由于酰胺键存在，导致1690～1500 cm-1、1650～1640 cm-1和1540～1550 cm-1区域处出现极值。1625～1610 cm-1区域吸光值表明芳香烃中有C=C和羰基、醌基存在。1470～1370 cm-1区域的折线表明存在典型的C-H、O-H，出现极值说明有C-O键存在。波长低于1000 cm-1的吸光值表明碳水化合物含量能够影响腐植酸的分子结构。1080 cm-1处吸光值表明OH变形或酚中C-O拉伸以及醇-OH的存在。1040 cm-1处吸光值表明多糖中C-O拉伸。研究结果证明，在腐殖物质成岩过程中，腐植酸官能团的组成发生了重要变化。从苔藓泥炭红外光谱变化比较来看，腐植酸的结构变化较为明显(图6)，这可能与碳水化合物的减少有关，也可能与1700 cm-1(1725～1700 cm-1)区域强烈的吸收值有关，吸收值大表明存在大量的羧酸。

图5 Dzelve沼泽不同深度泥炭腐植酸傅里叶变换红外光谱Fig. 5 Fourier transform infrared spectra of peat humic acids from Dzelve Bog depending on the depth of the sample

图6 成炭苔藓植物的傅里叶变换红外光谱Fig. 6 Fourier transform infrared spectra of peat-forming bryophytes

样品的ESR谱形状相对简单，且不同样品之间较为相似(图7)。所有光谱强度都比较强、且狭窄、对称，呈现出明显的Lorentzian谐振特征。所有样品g值和线宽(表5)大致相同，与半醌有机自由基和芳族烃的共轭程度一致。由于存在Fe3+，谱线以g=2.038为中心，呈不对称状分布，g=4.26和g=9.4的共振谱线与三价铁离子一致。增大ESR功率后，我们发现5.75 mT和17.3 mT的谱线相对于V4+在垂直方向和水平方向有耦合，8.7 mT的六条窄线与Mn2+离子劈裂耦合(图7)。

图7 Dzelve沼泽泥炭腐植酸1.90～2.00 m的电子自旋共振谱Fig. 7 Electron spin resonance spectra of peat humic acid (Dzelve HA 1.90～2.00 m)

尽管共振强度存在差异，但泥炭腐植酸ESR光谱特征(g值和线宽)几乎相同。研究表明，生化腐植酸腐殖化过程中，Fe3+被还原到Fe2+，自由基数量增加。然而，无论生物材料还是腐殖化条件，泥炭腐植酸都不同于生化腐植酸，但它们在泥炭主体中的变化趋势尚不明确。

表5 泥炭腐植酸ESR参数Tab. 5 ESR parameters of peat humic acids

裂解-气相色谱/质谱也是用来表征泥炭腐植酸常用的一种方法，Eipurs地区不同深度泥炭腐植酸的主要裂解产物分布情况见表6。CO2相对丰度可能与腐殖化过程中不稳定结构发生氧化有关。木材CO2产率约为5%，相比而言，泥炭，氧化程度较高大于30%。

表6 泥炭腐植酸热解产物的相对丰度Tab. 6 Relative abundance (%) of pyrolysis products of peat humic acids %

研究泥炭腐植酸的一个关键问题就是木质素降解问题。PY-GC/MS分析法是用来分析木质素降解产物及其在腐殖化过程中变化情况的一个首选方法。PY-GC/MS分析结果证实了腐植酸中芳香族化合物主要由不含木质素的酚类构成。在所有试验样品中，只有一个草本泥炭(Eipurs 410～456 cm)中含有保存完好的木质素碎屑。一般情况下，不同泥炭层的植物成分有所不同，腐植酸中芳香类物质/脂肪族的比率相对较低。泥炭腐植酸中脂肪和碳水化合物较多，含N化合物较少，表明其结构与水体、土壤和生化腐植酸不同。

不同类型碳原子的CP/MAS13C NMR光谱有所不同。一般情况下，光谱特征与脂类(C-H、C-N、O-CH3、其他原子团和多糖中的碳)和芳香族物质有关。按照不同结构的碳原子可以把13C NMR光谱(图8～图10)分为以下八个主要区域：

0～50 ppm，表明脂肪(烷基)片段中CHn的存在；60～90 ppm，表明碳水化合物的存在；140～160 ppm，表明烯烃或芳香烃中碳原子以碳环形式存在。羧基中的碳约占到碳原子总数的10%，是腐植酸结构的重要成分。有关腐植酸结构讨论的一个主要问题就是它的芳香性和脂肪性。事实表明，成炭的藓类植物几乎不含芳香类物质(通常是不同的泥炭藓物种)，Py-GC/MS分析结果表明，木质素残留物也几乎不存在，这进一步证实了腐植酸中芳香族化合物不含木质素。因此，可以推测，泥炭上部腐植酸主要成分中含有烯烃结构，而从底部泥炭层中分离的腐植酸含有的芳香类结构主要来源为木质素残留物。

图8 Dzelve沼泽泥炭腐植酸CP MAS13C NMR光谱Fig. 8 CP MAS13C NMR spectra of humic acids from Dzelve Bog

图9 Eipurs沼泽泥炭腐植酸CP MAS13C NMR光谱Fig. 9 CP MAS13C NMR spectra of humic acids from Eipurs Bog

图10 Dizpurvs沼泽泥炭腐植酸CP MAS13C NMR光谱Fig. 10 CP MAS13C NMR spectra of humic acids from Dizpurvs Bog

泥炭腐植酸CP MAS13C NMR光谱能够反映腐殖化过程中有机质的变化。最初，随着深度的增加，所有泥炭样品分离的腐植酸中，脂肪族(烷基)结构明显减少，Eipurs地区泥炭几乎减少了一半。而通常被认为易分解的碳水化合物中环碳原子并没有明显变化。与此同时，成炭的藓类植物与泥炭上部腐植酸中碳水化合物含量存在显著差异，这意味着活藓中碳水化合物只有一小部分被纳入到了泥炭腐植酸结构中去，说明泥炭藓碳水化合物在腐殖化过程中未充分降解。腐植酸类物质的一个主要特点就是酸性——羧基官能团的存在。研究表明，羧基和酯类含量在泥炭剖面中的变化并不明显。再次，如果与泥炭藓类植物组成的羧基官能团存在的重大差异相比，可以发现，其浓度在生活泥炭形成的生物样品结构中含量较低，这表明羧基出现在好氧层的活有机体降解的初始阶段。

根据图8～图10 CP MAS13C NMR光谱分析结果，不同泥炭层腐植酸的化学位移(ppm)表征了泥炭不同分子结构的共振谱。其中，0～50 ppm主要是脂肪族(CHn)碳共振谱(甲基、亚甲基和次甲基)。50～60 ppm主要是-OCH3共振谱。60～90 ppm主要是含杂环的碳水化合物的共振谱。90～110 ppm主要是环糖中含两个杂环原子(氧或氮)的缩醛共振谱。110～140 ppm表示未取代和被醇取代的芳香族碳原子(CAr)共振谱。140～160 ppm是氮氧取代(CAr-O，N)的芳族碳原子共振谱(例如酚类、芳族醚或胺等)。160～190 ppm主要是由羧基、酯和酰胺基中C共振产生。190～220 ppm主要由氮氧取代的醌和酮共振产生(例如酚类、芳族醚或胺等)。

将形成隆起式雨养沼泽的苔藓植物与其他常见雨养沼泽植物物种(如白齿泥炭藓、中位泥炭藓、赤茎藓等)以及苔藓、泥炭、泥炭腐植酸的CP MAS13C NMR作进一步比较(图11、图12和表8)。

图11 高位沼泽成炭的苔藓植物的CP MAS13C NMR光谱Fig. 11 CP MAS13C NMR spectra of raised bog peat-forming bryophytes

图12 高位沼泽成炭的苔藓植物、泥炭和腐植酸的CP MAS13C NMR光谱Fig.12 CP MAS13C NMR spectra of raised bog peat-forming bryophytes, peat and HA

成丘的苔藓植物、泥炭(0～25 cm)以及腐植酸光谱之间的差异主要表现在0～50 ppm、60～90 ppm和90～110 ppm。在苔藓植物腐殖化过程和腐植酸分子岩化作用的初期，含脂肪族C的结构开始出现，含-OCH3的结构随着腐殖化过程的进行而逐渐减少(图8～图10)。其中，60～90 ppm表示碳水化合物在腐殖化初期开始下降，并随着腐殖化过程持续进行而减少。90～110 ppm表示碳可能以含2个杂环原子的环糖形式存在，并在腐殖化过程中分解。在腐殖化初期，160～190 ppm(主要为羧基、酯和酰胺基)和190～220 ppm(主要为醌类和酮类)两个区域的共振强度没有明显变化，它们在后期才表现为显著增加。

泥炭腐植酸中官能团和主要成分的独特分布，说明微生物降解和地球化学变化导致腐植酸产物和结构发生变化。微生物降解产生有机生物材料，其中的化合物反应形成腐植酸。泥炭腐植酸的生物材料中含有大量的碳水化合物和脂类结构，却不含木质素。