丹参酮ⅡA下调凋亡抑制蛋白XIAP诱导人肝癌细胞凋亡的研究

姜清等

【摘要】 目的：探讨丹参酮ⅡA对肝癌细胞中凋亡抑制蛋白XIAP的影响。方法：通过MTT实验、流式细胞术、细胞形态观察检测丹参酮ⅡA对细胞增殖和凋亡的影响，通过蛋白免疫印迹的方法检测丹参酮ⅡA对细胞中凋亡抑制蛋白XIAP、凋亡蛋白caspase-3以及PARP蛋白的影响。结果：MTT、细胞形态结果显示丹参酮ⅡA对SMMC-7721细胞的生长抑制作用成时间和剂量依赖性，免疫印迹结果显示，0.5 μg/mL丹参酮ⅡA作用肝癌细胞24 h后，caspase-3前体、凋亡抑制蛋白XIAP表达明显下调，活化的caspase-3、剪切形式的PARP含量显著增加。结论：丹参酮ⅡA下调凋亡抑制蛋白XIAP，活化caspase-3，促进PARP剪切诱导肝癌细胞凋亡。

【关键词】 丹参酮ⅡA； 肝癌； 凋亡； XIAP

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of inhibitor of apoptosis protein XIAP in hepatocellular carcinoma cells treated with Tanshinone ⅡA.Method：Effect of Tanshinone ⅡA on cell proliferation and apoptosis were determined by MTT test，flow cytometry and cell morphology observation.The effects of Tanshinone ⅡA on inhibitor of apoptosis protein XIAP，apoptosis related proteins procaspase-3 and PARP protein in cells were measured by Western blot.Result：MTT，cell morphology results showed that Tanshinone ⅡA inhibited the growth of SMMC-7721 cells in a dose and time dependent manner，Western blotting results showed that 0.5 μg/mL tanshinone ⅡA in hepatocellular carcinoma cells after 24 h，Caspase-3 precursor，inhibitor of apoptosis protein XIAP expression were down regulated，the content of PARP，caspase-3 splicing activation increased significantly.Conclusion：Tanshinone ⅡA can down regulate XIAP protein，activate caspase-3 and promote PARP shear，and induce apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.

【Key words】 Tanshinone ⅡA； Hepatocellular carcinoma； Apoptosis； XIAP

First-authors address：The Peoples Hospital of Xinyu City，Xinyu 338000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.22.004

肝癌属世界上的较为常见的恶性肿瘤之一，在成人中发病率较高，约占80%左右，数据显示，其5年存活率在7%左右，每年约60万人死于肝癌，严重影响人们的健康。近年来，中药治疗肿瘤，尤其是在诱导肿瘤细胞凋亡方面的研究，成为医学研究的重点方向。寻求诱导肿瘤细胞凋亡的中药提取物逐步成为当前肿瘤治疗的热点和重点。丹参酮ⅡA是中药丹参中提取出来的有效成分，在抑制肿瘤细胞生长、诱导细胞分化、促进细胞凋亡方面有着很好的效果，从而达到抗癌的效果[1]，但是其具体作用机制仍然不清楚。X相关凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）是细胞中重要的凋亡抑制因子，其过度表达往往导致肿瘤的发生[2]。近年来研究表明，XIAP在肝癌细胞中表达明显升高，并且与肝癌转移、耐药以及复发密切相关[3]。因此，XIAP已经成为肝癌治疗的靶点分子。本研究工作中，笔者探讨丹参酮ⅡA诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的过程中对XIAP蛋白的影响，为丹参酮ⅡA用于临床治疗肝癌提供实验依据和理论基础，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 丹参酮ⅡA、二甲亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自Solarbio公司，RPMI1640培养基、小牛血清购自Gibco公司。兔抗人XIAP、caspase-3、PARP抗体购自Cell Signaling公司，鼠抗人-actin抗体购自Sigma公司，HRP-羊抗鼠Ig-G、HRP-羊抗兔Ig-G抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司，显影液ECL购自Millipore公司。

1.2 细胞培养 肝癌细胞株（SMMC-7721）购自中国科学院上海生命科学院。细胞在含10%小牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 U/mL的链霉素的RPMI1640培养基中，37 ℃、5%CO2条件下培养，使细胞密度维持在60%～80%的最佳生长状态。

1.3 细胞增殖实验 取生长良好的SMMC-7721细胞2×103/孔接种于96孔细胞培养板，采取不同浓度的丹参酮ⅡA（0、0.5、1、2、5、10、20 g/mL）对细胞进行处理，处理时间为24 h和48 h，每个浓度做5个复孔，培养结束后每孔加入MTT10 L（10 mg/mL），将其进行继续培养，继续培养时间为4 h，离心去上清后加入DMSO（150 L/孔），于37 ℃条件下将其孵育30 min，使得细胞得以溶解，用酶标仪测定其在490 nm波长处的吸光值。细胞生长抑制率=（1-实验组吸光值/对照组吸光值）×100%，并通过ICp计算软件计算出药物作用不同时间的半数抑制率（IC50）。

1.4 细胞形态观察 肝癌细胞及不同浓度丹参酮ⅡA作用后，在倒置显微镜下观察细胞形态、细胞数量的变化情况并通过摄像记录。

1.5 流式细胞术检测细胞周期 SMMC-7721细胞经0.5 μg/mL的丹参酮ⅡA处理24 h后，从其中进行细胞收集，收集的细胞数量为1×106个细胞，选取PBS缓冲液进行冲洗，冲洗次数为2次，对其进行离心。离心完成后，用300 LPBS重悬，加入700 L无水乙醇，使得乙醇浓度达到70%，将其放置在-20 ℃环境下固定过夜，对其进行离心，离心完成后取细胞沉淀，选取含250 mg/mL的RNaseA的PBS，4 ℃条件下进行孵育，孵育时间为30 min，使得细胞中的RNA得以去除。然后加入50 LPI（mg/mL）染料，于4 ℃条件下进行孵育，孵育时间为30 min，1 h内用流式细胞仪进行分析。

1.6 蛋白免疫印迹 SMMC-7721细胞经丹参酮ⅡA处理不同时间后，用蛋白裂解液（100 mmol/L Tris-base、4%SDS、5%-巯基乙醇、20%甘油、pH为6.8）提取蛋白，蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至0.45 m的硝酸纤维膜上，然后用相应的抗体检测蛋白的变化情况，具体方法见文献[4]。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹参酮ⅡA对肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响 通过MTT实验检测丹参酮ⅡA对肝癌细胞SMMC-7721的生长的抑制作用。实验结果显示，不同浓度的丹参酮ⅡA作用细胞不同时间后，细胞生长受到不同程度的抑制，并成时间和剂量依赖性（图1），通过ICp软件计算出丹参酮ⅡA作用细胞24 h时的半数抑制浓度（IC50）为2.50 μg/mL，而48 h的IC50为0.46 μg/mL。

2.2 丹参酮ⅡA对肝癌SMMC-7721细胞形态的影响 SMMC-7721细胞经不同浓度的丹参酮ⅡA处理48 h后，通过倒置显微镜观察细胞形态的变化。结果显示，未经药物处理的细胞贴壁生长，细胞形态成条梭型，细胞折光性好。实验组经药物处理后，可见细胞成凋亡形态学改变，表现为部分细胞悬浮，折光性降低，细胞体积变小、变形；随着药物浓度的加大，凋亡的细胞数量增加，细胞形态改变更明显（图2），表明丹参酮ⅡA可以诱导细胞凋亡。

2.3 丹参酮ⅡA对肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响 细胞用0.5 g/mL的丹参酮ⅡA处理48 h后，通过流式细胞术检测细胞周期的变化。从图3中可以发现，加药处理后，G0/G1期细胞比例明显增加，有对照组的53.2%增加到63.0%，而处于S期，G2/M期的细胞明显减少。同时，还看到在G0/G1峰前还出现一个小峰，代表凋亡的细胞，这也表明，丹参酮ⅡA可以具有抑制细胞生长，促进细胞凋亡的功能。

2.4 丹参酮ⅡA对凋亡相关蛋白的影响 蛋白免疫印迹实验显示，0.5 μg/mL的丹参酮ⅡA可以下调分子量为32 kD的caspase-3前体蛋白，并促进PARP蛋白的剪切，使得116 kD的PARP蛋白随着作用加药时间而减少，85 kD的剪切形式的PARP蛋白明显增加（图4）。

2.5 丹参酮ⅡA对凋亡凋亡抑制蛋白XIAP的影响 研究表明，XIAP蛋白是细胞中唯一可以直接与caspase蛋白相互作用并抑制细胞凋亡的蛋白，同时也有报道XIAP在肝癌细胞中高表达。笔者检测了丹参酮ⅡA对肝癌细胞中XIAP的影响，Western blot实验结果显示，丹参酮ⅡA处理细胞6 h后，细胞中的XIAP就开始下降，24 h后就明显下降（图5）。

3 讨论

丹参酮ⅡA是从活血化瘀的中药丹参中提取脂溶性有效成分，其结构中含有醌型结构，容易被氧化还原，能够和机体内的多种生化反应共同发生，生物活性较强[4]。多项研究发现，丹参酮在临床上治疗心血管疾病和关节炎方面，有着很好的疗效。近年来，部分研究资料表明，丹参酮ⅡA具有抗肿瘤活性，能够在肿瘤细胞的杀伤、诱导、分化方面发挥较好的作用[5]。本研究显示，0.5～10 g/mL丹参酮ⅡA均能抑制肝癌细胞SMMC-7721细胞生长，并且这以生长抑制作用具有明显的时间和剂量依赖性。同时通过形态观察、细胞周期分析，发现丹参酮ⅡA处理细胞后，细胞形态出现凋亡改变，处于G0/G1期的细胞明显增加，而处于S期、G2/M期的细胞含量明显减少，同时还出现亚G1峰的细胞，这提示细胞发生了凋亡，提示丹参酮ⅡA的作用与诱导肝癌细胞凋亡密切相关。

凋亡抑制蛋白XIAP（X-linked inhibitor of apoptosis protein）也叫做MIHA/hILP/BIRC4，基因定位于人Xq25，共含有7外显子和6内含子，其mRNA全长8413 bp，编码区位于129～1622 bp之间，其编码的蛋白XIAP相对分子量约57 kDa[6]。研究表明，XIAP分子可以选择性的直接结合和抑制启动凋亡的凋亡蛋白caspase-9和发生凋亡效应的凋亡蛋白caspase-3和caspase-7，但是不能抑制其他caspase的活性，表明XIAP在细胞凋亡中发挥重要的作用[7]。近年来研究表明，XIAP在肝癌细胞以及肝癌组织中表达都比在正常组织细胞中的要高，这一研究结果证明XIAP可能与肝癌的发生、发展过程有着一定的相关性[8-9]。有研究发现在肝癌细胞中过表达XIAP可以使得肝癌转移和复发发生率增加[10]。该研究可以得出，约90%的患者在病情发展到进展期的肝癌时候，其肿瘤细胞中XIAP的表达有明显的提升[11-12]。在本研究中发现，丹参酮ⅡA可以下调XIAP蛋白，同时可以减少caspase-3前体的表达，促进PARP蛋白的剪切，PARP蛋白是细胞核中的骨架蛋白，PARP蛋白的剪切可导致细胞核破坏，导致细胞凋亡。这表明丹参酮ⅡA可能是通过调节XIAP蛋白的表达来诱导肝癌细胞凋亡的，但是丹参酮ⅡA调控XIAP的机制并不清楚，接下来笔者还将继续探讨其分子机制。

在本文中，丹参酮ⅡA下调凋亡抑制蛋白XIAP并诱导肝癌细胞SMMC-7221细胞凋亡，为丹参酮ⅡA治疗肝癌提供实验依据和理论支持。

参考文献

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[2]李庆霞，杨安钢.凋亡抑制蛋白XIAP的研究进展[J].医学分子生物学杂志，2004，1（2）：113-115.

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[10]承韶晖.丹参酮ⅡA磺酸钠对脑缺血再灌注模型大鼠神经保护作用的研究[D].安徽医科大学，2013.

[11]黄彦思.厄贝沙坦联合丹参酮ⅡA治疗糖尿病肾病临床疗效观察[J].中国医学创新，2012，9（13）：41-42.

[12]吴江.井贵平.丹参酮ⅡA磺酸钠对脑梗死血液指标的影响及疗效评价[J].中国医学创新，2011，8（20）：19-21.

（收稿日期：2014-02-28） （本文编辑：欧丽）

在本文中，丹参酮ⅡA下调凋亡抑制蛋白XIAP并诱导肝癌细胞SMMC-7221细胞凋亡，为丹参酮ⅡA治疗肝癌提供实验依据和理论支持。

参考文献

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（收稿日期：2014-02-28） （本文编辑：欧丽）

在本文中，丹参酮ⅡA下调凋亡抑制蛋白XIAP并诱导肝癌细胞SMMC-7221细胞凋亡，为丹参酮ⅡA治疗肝癌提供实验依据和理论支持。

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[12]吴江.井贵平.丹参酮ⅡA磺酸钠对脑梗死血液指标的影响及疗效评价[J].中国医学创新，2011，8（20）：19-21.

（收稿日期：2014-02-28） （本文编辑：欧丽）