分子探针在疾病诊疗中的应用与展望

鹿蓉+姚振威

摘 要 分子探针作为分子影像学不可或缺的载体，其制备方法伴随分子影像学仪器的发展而不断得到更新换代。无论是肿瘤和心血管疾病等常见病、多发病，还是基因病、少见病，当前疾病的诊断与治疗已经逐渐趋向于个体化。如何更快速地识别疾病的早期影像学变化并在此基础上予于治疗，这是分子影像学研究的重点。

关键词分子影像学分子探针超顺磁性氧化铁微泡

中图分类号：R981; Q503文献标识码：A文章编号：1006-1533(2014)13-0016-07

Exploration and prospect of molecular probes for disease diagnosis and treatment

Lu Rong*, YAO Zhenwei**

(Department of Radiology, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China)

Abstract Molecular probe is used as an indispensable vector of molecular imaging and its preparation method is frequently updated and renovated with the synchronous development of its equipment. Whatever a common or frequently-occurring disease such as tumor, cardiovascular disease, or genetic and rare disease the patients suffer from, the diagnosis of disease and its targeted treatment have gradually tended to be individualized. It is the focus of the study of molecular imaging for us how to more quickly identify the early changes in the disease imaging and meanwhile to give a treatment on the basis of this information.

Key wordsmolecular imaging; molecular probes; superparamagnetic iron oxide; microbubble

近年来，分子影像学不断推陈出新，从仪器设备的发展到分子探针的设计及研制，从探索疾病病理生理机制到对疾病的检测、诊断乃至同步治疗，分子影像技术不仅能在组织、细胞甚至分子水平对特定分子进行活体成像以显示其生物学行为，而且还能对特定分子进行定性和定量研究，在药物研究以及疾病的检测、诊断和治疗等方面具有广泛的应用前景[1]。

光学成像工具（包括新型荧光素探针）最早被发展用于细胞生物学研究[2-3]。1995年，Richard Klausner成为美国国家癌症研究所（National Cancer Institute, NCI）的新负责人，他致力于以分子生物学为基础重新构建肿瘤研究[4]。通过肿瘤成像项目的首次“小型动物成像资源项目（Small Animal Imaging Resource Programs）”，NCI于1999-2000年间成立了“体内细胞和分子成像中心（In vivo Cellular and Molecular Imaging Centers）”，自此放射学家开始涉足分子影像学这个崭新的领域。

现代生物学相当依赖微型工具和仪器的自动化高速进程形式，以往那种费时的操作过程如用Northern Blots法识别mRNA已经被高效的寡核苷酸微阵列分析所替代。新型基因序列检测技术已成功用于人类基因组测绘。cDNA和核苷酸微阵列技术、新型质谱仪、蛋白质微阵列和组织微阵列技术也已被用于深入探究转录组和蛋白质组的细胞核组织水平[5]。

目前已产生了“系统生物学”这个新的学科，以期能解答如下极具挑战的问题：在浩瀚的信息体中，在一种不同组成水平和不同有机体里发展一种新的工具来整合基因、蛋白质、细胞、组织、器官和整个有机体的信息，从而了解它们对环境变化作出精确应答的网络[6]。

肿瘤学家更注重疾病的预防、早期诊断、个体化治疗和治疗监控。多年的肿瘤研究发现，肿瘤是一种基因疾病[7]。Vogelstein等[8]将肿瘤细胞定义为一种“因体细胞突变而无性繁殖的细胞”。但与单一基因疾病如囊性纤维化或肌营养不良不同，肿瘤是多重基因缺陷导致的后果。分子通路的小部分缺陷决定了许多肿瘤的类型，故对特异性分子通路的直接修复可用于治疗不同类型的肿瘤。Vogelstein等还认为，肿瘤改变的基因会促使产生新一代诊断测试方法，这种测试方法将使用特异性的靶向成像技术或分析来自体内的体液样本，从而使早期诊断更为可能。

由分子生物学家的“基因-酶”模型到系统生物学家的网络，Tracy[9]提出了“深度表型（deep phenotyping）”的新概念，它主要是指生物通路和代谢通量相关性增加的“粒度”表型。而为了使放射学家在深度表型方面发挥更为重要的作用，临床上必须建立客观、定量、可再生和标准化的生物成像标志物[10]。

如果放射学家能够利用近年来的研究成就并能在将来成为疾病诊断信息的主要提供者和整合者，分子影像学将得到飞跃的发展，反之则会一直局限于病理学家所能提供标准的水平[11]。

1分子探针的发展现状

多种分子影像技术，如磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）、正电子发射断层显像（positron emission tomography, PET）、单光子发射计算机化断层显像和光学成像技术等在当今的药物开发和疾病诊断中都已有一定程度的应用，但由于自身灵敏度、选择性、分辨率以及安全性等方面的原因，在实验研究和临床应用中仍存在相当的局限性。双模态分子影像学技术的出现和发展有助于解决这些问题，它通过两种不同分子影像探针的“合二为一”、即同时使用两种不同的分子影像学技术进行检测，可在两种不同的分子影像学技术之间取长补短、优势互补，从而极大地拓宽分子影像学的研究范围和应用前景[12-13]。

近年来，随着纳米技术的发展，功能性量子点、纳米金和稀土材料等在分子影像学中均得到了重视。

分子影像学成像必须满足3项必备条件：①高亲和力的分子探针；②化学或生物信号放大技术；③高灵敏度、快速和高分辨率的成像技术，如反义基因、受体、干细胞和肿瘤生长基因等的显像技术。理想的特异性分子探针应具有组织相容性、放大的可探测信号、背景噪音小或无和安全等特点。分子探针可分为靶向探针和可激活探针两类[14]。

靶向探针由与靶分子具有亲和性的配体如抗体、肽或小分子化合物经特定的方法与放射性同位素、荧光素、顺磁性复合物或声学对比剂连接后形成，其中配体为可与靶分子特异性结合的物质，而放射性同位素、荧光素、顺磁性复合物或声学对比剂则是产生影像信号的物质。靶向探针的缺点是背景噪音大，需经一定时间待血液中的游离靶向探针被代谢清除之后方能较好地显示靶分子的影像信号，目前可用于分子结构及分布显像。

可激活探针又称智能探针，系利用预靶向分子激活特定的分子事件并用特异性的分子探针探测而显像，可大大提高所获影像的信噪比，目前已开发出数种光学和MRI的可激活探针，具有广阔的应用前景。

2各种成像技术中的分子探针

2.1MRI分子探针

MRI分子探针是以纳米材料为基础合成的一系列复合物，现常用的有钆或锰螯合物和以氧化铁为基础的分子探针。由于钆螯合物与大分子抗体或蛋白质结合后不能被肾脏滤过和排除、在体内长期滞留后可导致肾纤维化等不良反应，而锰螯合物在高浓度时有生物毒性，故以大小不同的超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxide, SPIO）颗粒为基础的MRI分子探针的应用更广，其注入人体内后主要为单核细胞和巨噬细胞所摄取，且能通过代谢被生物体再利用，具有良好的生物相容性。但因为脑内树突细胞和干细胞能够吞噬500 ~ 1 000 nm的SPIO、在MRI上呈低信号，所以会导致与肿瘤显像的地信号图像相混淆[15-17]。

超微超顺磁性氧化铁（ultramicro superparamagnetic iron oxide, USPIO）的颗粒比SPIO更小，直径一般＜50 nm，扩散能力弱，能被具有代谢活性的细胞（如癌细胞和肿瘤浸润巨噬细胞）所吞噬，故可改善肿瘤边界的显像，对肿瘤的诊断性活组织检查以及手术切除的设计具有重要价值。

联合使用纳米颗粒对比剂和MRI能准确鉴别出所有有淋巴结转移的患者和94%的有转移的淋巴结，判断无转移患者及淋巴结的准确率分别为95.7%和97.5%，甚至可以鉴别出大小正常的淋巴结内2 mm大小的转移灶[18]。

根据MRI大分子对比剂在肿瘤细胞外基质（extracellular matrix, ECM）内会向血管外转运的现象，可定量评估ECM的完整性。对不同侵袭性乳腺癌模型的MRI大分子对比剂成像显示，间质内流体转运、淋巴液引流和腋窝淋巴结的显像存在着显著差异，证实淋巴结转移与ECM的完整性有关[19]。

2.2超声成像分子探针

对比增强的超声成像是利用多脉冲技术进行显像的非线性探测方法，最常见的双脉冲序列有反向脉冲谐波（pulse inversion, PI）和振幅调制（amplitude modulation, AM）两种。大多数多脉冲技术是建立在PI、AM或两者混合（PI-AM）的基础上的[20]。

超声分子成像是依赖于微泡靶向疾病或者其他声学活动性微粒载体的探测方法。

联合使用缺血记忆成像和心脏超声已能通过抗体或糖蛋白表面的共轭微泡来标记上皮细胞黏附分子P-选择素。P-选择素标记成像展现了其探测心肌和肾缺血损伤的能力，甚至能够在梗死未出现时即修复缺血性损伤。通过瞄准缺血性损伤持续至少24 h后出现的E-选择素，分子成像能高效地探测出缺血灶，这样也许可能延长缺血灶恢复的时间窗[21]。鉴于缺血性记忆的分子成像特点，其极有可能会被首先用于对人心血管疾病的检测。

研究者还探索了通过瞄准内皮细胞黏附分子对动脉粥样硬化的分子成像。在动物模型中，细胞间黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1和P-选择素在斑块形成和显示潜在的斑块炎症活动中产生了信号增强效应[22-24]。

微泡靶向标记血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体、纤维蛋白、组织因子、von Willebrand因子可探测斑块破裂后形成的血管内和腔内血栓，警示动脉粥样硬化合并症如微血栓的形成以及高风险性栓塞和炎症表型[25-28]。更为可喜的是，使用微泡和超声能量还能够去除血栓[20]。

在肿瘤血管上皮细胞上有多种过度表达的分子标志物[29-30]，微泡瞄准血管生成标志物如血管内皮细胞生长因子受体-2、αvβ3-整合素或内皮因子等进行微泡多目标对比能够提高肿瘤血管生成的检测率，使在不同时间点表达的不同标志物在肿瘤早期进展中的探测变得更有意义。此外，靶向超声造影剂（如亚微米级微泡）能进入血管外间隙对血管外组织显影，这为前列腺癌的诊断和治疗提供了新的思路[25]。

2.3PET成像分子探针

PET可应用进入人体并参与体内生物代谢活动的各种示踪剂评价其代谢功能。示踪剂分子探针有——1）18F-氟代脱氧葡萄糖：能被组织细胞吸收并代谢为6-磷酸18F-氟代脱氧葡萄糖，可以激活脑功能区的葡萄糖代谢率而提供脑局部代谢情况，但鉴别炎症和肿瘤仍有困难。2）受体显像剂：①11C-氟马西尼是中枢神经系统苯二氮䓬受体拮抗剂，可用于癫痫灶的定位及评价癫痫外科手术的效果，显示大脑皮层和颞中回的癫痫病灶的灵敏度和特异性很高，还可用于脑卒中后缺血半暗带的精确鉴别；②11C-蛋氨酸易透过血脑屏障，可用于检查脑胶质瘤及转移灶，根据其在肿瘤组织中的聚集情况来评估肿瘤增殖率。3）乏氧显像剂：18F-佛米索硝唑能在乏氧组织中积聚，与氧化活动成反比。4）11C-乙酸盐：被心肌细胞摄取后会在线粒体内转化为11C-乙酰辅酶A，然后进入三羧酸循环并被氧化成二氧化碳和水，与心肌耗氧量成正比，借此可以评估心肌活力。

2.4光学成像分子探针[31]

荧光探针仅在其高水平表达时才会在由肿瘤产生的特异性蛋白酶溶解时释放荧光，能呈现肿瘤的生长和浸润以及供应肿瘤氮和氧的血管生成。但其穿透力有限、为数毫米到数厘米，目前仅可用于小动物模型的研究。

3分子探针在疾病诊断中的应用

3.1心血管疾病的分子探针

分子探针可对巨噬细胞、凋亡、炎症、血管生成和凝血过程等进行不同分子靶标的成像，也可对动脉粥样硬化病理过程中的不同分子机制进行成像。

3.1.1核医学成像技术的分子探针

胞内报告基因包括单纯疱疹病毒-1胸苷激酶（herpes simplex virus 1 thymidine kinase, HSV1-tk）及其突变体HSV1-sr39tk。细胞表面受体的报告基因包括2型多巴胺受体、2型人生长抑素受体及人钠-碘同向转运子（human sodium-iodine symporter, hNIS）。HSV1-tk及其突变体HSV1-sr39tk是PET基因表达显像中研究最广泛的报告基因。

Miyagawa等[32]将接种hNIS基因后的腺病毒直接注入鼠的心肌内，然后通过123I和99mTc在动态伽马显像仪显像，结果观察到注入腺病毒-hNIS组大鼠的心肌有放射性浓聚且持续时间较长，由此提示hNIS报告基因在心脏基因和干细胞治疗的实时检测中具有很好的应用前景。

3.1.2MRI技术的分子探针

氧化铁微粒作为影像学标记的分子探针主要包括SPIO、USPIO和单晶体氧化铁颗粒等。SPIO可用于心肌缺血干细胞移植治疗的细胞示踪[33]，且现已成为细胞示踪的首选对比剂。SPIO还有望用于血管炎性病变显像。

以纤维蛋白为对比剂的分子探针可对血栓进行选择性的无创MRI显像。将解剖成像与反应血管壁成分的特异性成像相结合还可显示冠状动脉、心房和肺内的血栓，表现为明显高信号[34]。

3.1.3超声成像技术的分子探针

缺血记忆成像联合心脏超声已经能够通过抗体或糖蛋白表面的共轭微泡来标记上皮细胞黏附分子P-选择素，从而对组织缺血性进行探测[35]。

微泡靶向标记血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体、纤维蛋白、组织因子、von Willebrand因子可探测斑块破裂后形成的血管内和腔内血栓，警示动脉粥样硬化合并症如微血栓的形成以及高风险性栓塞和炎症表型，也有可能同步去除血栓。

3.1.4光学成像技术的分子探针

生物发光是指用荧光素酶基因标记细胞或DNA。在体内，荧光素酶在三磷酸腺苷和氧气存在的条件下会与注入的外源性特异性底物反应而产生发光现象。只有在活细胞内才会出现发光现象，且发光强度与标记细胞数线性相关。荧光发光采用荧光报告基因绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白进行标记，然后通过激光激发荧光基团至高能量状态，从而产生发射光。以绿色荧光蛋白作为报告基因的光学成像技术能在活体内定位荧光蛋白表达的具体部位，显示血管和心脏内荧光蛋白基因表达的水平及持续时间[36]。

3.2阿尔茨海默病的分子探针

神经纤维缠结（neurofibril tangle, NFT）曾被认为是阿尔茨海默病的病理标志之一。但近年来，tau蛋白的可溶性聚集、特别是tau蛋白寡聚物的过度磷酸化被认为是阿尔茨海默病的基本病理标志。tau蛋白寡聚物形成于阿尔茨海默病的早期，早于NFT形成。不幸的是，人们对tau蛋白的聚集过程了解甚微，很少能制备tau蛋白靶向的成像探针。

Kim等[37]通过制备一种新型的tau蛋白靶向的近红外比率计探针（ratiometric probe）CyDPA2研究了tau蛋白的病理机制和阿尔茨海默病的早期诊断。另外，Ojida等[38]利用氟化硼二吡咯为基础的荧光素探针探测NFT。Ono等[39]发现，硫乙内酰脲衍生物能在体内与NFT特异性结合。

近年来，作为一种新型放射示踪剂，18F标记的PET配合基已被用于对tau蛋白成像[40]。过度磷酸化的tau蛋白的聚集在阿尔茨海默病小鼠模型中已被探测到[41]。在临床上，视网膜光学成像是可转移的。尽管人大脑的光学成像会因组织侵入性而变得颇具挑战，但是眼睛透明的本质允许运用视网膜成像这种方式。视网膜近红外荧光素成像已被用于临床[42-44]。

由于血脑屏障、脂溶性、分子量、负载电荷、三级结构和蛋白质结合等原因，分子探针很少能被递送[45]，但视网膜递送分子探针就没有这种困难。因此，以CyDPA作为载体可以通过视网膜进行平移的光学成像。在3种类型的CyDPA中，CyDPA2与tau蛋白的近红外探针的亲和性最高[46]。

3.3肿瘤诊断相关分子探针

3.3.1胰腺癌的分子探针

Sugyo等[47]在胰腺癌小鼠模型上评估了应用89Zr标记的人抗CD147单克隆抗体作为PET探针探测胰腺癌的可能性。胰腺癌在其转移阶段有CD147高表达，故CD147被认为是一种靶向治疗的极佳靶点。

CD147是一种跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，参与许多生理过程如精子形成、胚胎着床、淋巴细胞激活、神经网络的早期形成和一元羧酸转运体的诱导[48]。CD147可诱导产生基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP），如MMP-1、MMP-2、MMP-9和膜型-1 MMP以及血管内皮生长因子，其在转染乳腺癌细胞中的过度表达会导致肿瘤生长和转移[49]，提示CD147涉及肿瘤的侵袭、转移、血管生成和分化。

3.3.2炎症性肠病相关结、直肠癌的分子探针

Foersch等[50]使用环氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）的特异性荧光素探针并通过共焦点内镜探测了大鼠模型中分散的炎症性肠病相关结、直肠癌。在将COX-2探针注入患有肿瘤的APCmin或因暴露于致癌剂氧化偶氮甲烷和致炎症试剂右旋糖苷硫酸钠而患有炎症相关癌症的大鼠体内后，大鼠体内的COX-2能被荧光素成像所探测。该方法也能检测到癌前组织中的上调了的COX-2。COX-2分子靶向成像有望在不远的将来用于常规内镜检查，后者既可检测肠发育不良、又可确定化学性预防的时机。

3.3.3肝癌异种移植的分子探针

之前有研究报道，精氨酸-精氨酸-亮氨酸（arginine-arginine-leucine, AAL）能作为肿瘤内皮细胞的特异性结合序列。Zhao等[51]应用99mTc标记的AAL分子探针在肝癌异种移植模型上检测到了肿瘤血管生成。实验结果显示，99mTc- AAL能够选择性地聚集在肿瘤的微血管中。

3.3.4非小细胞肺癌的分子探针

肺癌是世界上致死率最高的肿瘤，但至今还没有非常有效的早期肺癌检测技术。

李贵平[52]应用巯基乙酰三甘氨酰-N-羟基丁二酰亚胺酯作为双功能螯合剂，经以99mTc标记制备了肺癌特异性靶向小分子多肽核素分子探针。Yao等[53]提出了可用新型分子灯塔标记miR-155诊断非小细胞肺癌。miR-155在体外可被激光共聚焦显微镜检测到，在体内能被立体显微镜成像系统检测到。

miRNA表达与多种肿瘤密切相关，如miR-17-92群和小细胞肺癌有关、miR-181与乳腺癌有关[54-57]。

3.3.5前列腺癌的分子探针

前列腺癌已在欧美国家成为继肺癌之后的第二大严重危害老年男子健康的肿瘤[58]。

任静等[59]应用纳米金磁微粒标记抗人前列腺干细胞抗原（prostate stem cell antigen, PSCA）单克隆抗体7F5制备PSCA特异性的MRI分子探针7F5@GoldMag，检测其与前列腺癌细胞结合的特异性并探讨了其用于前列腺癌体外及体内MRI成像的可行性。

Matsumoto等[60]发现，在前列腺癌穿刺中应用sonazoid超声造影剂可明显提高癌性病变区的显示率。亦有在实验犬中用SonoVue实时监测前列腺癌射频消融术的报道[61]。Sana等[62]通过将靶向前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen, PSMA）的脲类抑制剂与形成微泡外壳的聚乳酸乙醇酸-聚乙二醇相连制备了能够靶向表达PSMA的前列腺癌细胞的超声造影剂，有望用于诊断前列腺癌并成为潜在的药物递送载体[63]。

3.4检测炎症的分子探针

Waiczies等[64]使用双调谐鸟笼式线圈进行19F/1H-MRI显像，以探测自身免疫性脑脊髓炎。

α-肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α, TNF-α）是许多炎症和自身免疫性疾病如类风湿关节炎、克罗恩病、多发性硬化病和慢性乙型肝炎产生的炎症前因子[65-66]，以溶解和跨膜形态这两种形态出现在炎症区域，是极佳的炎症靶点。

Sclavons等[67]在由伴刀豆球蛋白A诱导的经典鼠肝炎模型上应用噬菌体显示TNF-α结合肽进行炎症探测，结果显示循环形式的2C肽和氧化铁纳米颗粒共价结合物能够指引炎症区域的对比剂成像。

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（收稿日期：2013-10-22）