油菜素甾醇信号通路中BKI1互作蛋白ERD7的筛选与鉴定

程 鳞，张 弛，蒋建军，苏 伟，王学路

(1.复旦大学生命科学学院植物科学研究所，上海200433;2.复旦大学遗传工程国家重点实验室，上海200433)

油菜素甾醇(Brassinosteroid，BR)是一类重要的植物激素，广泛存在于植物的大部分组织器官中.在拟南芥中进行的遗传学研究揭示了BR在植物生长发育中具有重要的地位，它调控了植物生长发育的各个方面，包括茎的伸长、维管组织的分化、光形态建成、种子的萌发、植物的育性、衰老以及对多种生物和非生物胁迫的反应等［1］.

1997年通过对BR不敏感突变体的筛选，鉴定到BR的细胞膜受体BRI1(Brassinosteroid Insensitive 1)［2］，它编码一个富含亮氨酸的类受体激酶(LRR-RLK)，具有丝苏氨酸和酪氨酸自磷酸化活性［3-5］，BRI1含有一个感知BR信号的胞外结构域［6］、一个跨膜区和一个传递信号至下游组分胞内结构域［7］.目前已发现受体BRI1的活性还受到其他蛋白的调节.当BR与BRI1的胞外域相结合后，BRI1与其共受体BAK1(BRI1-Associated Receptor Kinase 1)相互作用，形成异源二聚体，同时BRI1和BAK1发生自磷酸化或相互磷酸化，将信号传递到下游组分［8-9］.此外，BKI1(BRI1 Kinase Inhibitor 1)作为BR信号通路的负调节因子，在没有BR信号的时候，与BRI1结合抑制BRI1的磷酸化活性.

使用BRI1进行酵母双杂交筛选，显示BRI1能够与BKI1相互作用.没有BR信号时，BKI1定位于细胞膜上，能够与BRI1相互结合，这种结合能竞争性抑制BRI1与BAK1的结合，从而抑制BRI1-BAK1受体复合体的激活过程.遗传学分析显示，BKI1过表达植株表现为矮小，表明BKI1对BR信号传递有负调控的功能［10-11］.当BR与BRI1结合后，BKI1迅速从膜上解离，进入胞质，解除对BRI1的抑制作用［10］.在这个过程中，BKI1作为BRI1的底物，能够被BRI1磷酸化，磷酸化位点为Ser-270，Ser-274和Tyr-211［11］.其中BKI1的C末端Ser-270，Ser-274两个位点的磷酸化能促使BKI1从细胞膜上解离到细胞质中［12］.BKI1的C末端由20个氨基酸(306～325)组成，它们是介导BKI1与BRI1相互作用的关键序列［11，13］.但是，在BKI1过表达植株中，表达量较低的植株与表达量较高的植株相比，植株变大、下胚轴变长.对这一现象的深入研究表明，磷酸化的BKI1能与14-3-3蛋白相互作用，进而竞争性抑制14-3-3与BES1的结合，促进BES1的去磷酸化，行使正调控BR信号转导的功能［12］.因此，BKI1在BR信号通路中起到正负调控的双重作用.

拟南芥中的ERD7蛋白含有一个衰老结构域，被归为一类衰老相关蛋白.ERD7基因最早通过差异杂交的方法被鉴定，其表达受干旱胁迫的诱导［14］，之后通过microarray技术发现它的表达受到多种因素的影响.在冷、强光、高盐等处理下，ERD7的表达量会增加［15-17］.在检测拟南芥对砷胁迫的反应时，发现ERD7等4个与衰老相关的基因在砷胁迫下表达量下调［18］.在一个对蔗糖和渗透剂敏感的拟南芥sweetie突变体里，ERD7等7个与衰老相关的基因表达量上调，sweetie突变体还表现出叶片、萼片、花瓣衰老加速的表型［19］.多种植物激素都参与到拟南芥对胁迫的响应，ERD7的表达也受到几种激素的调节.基因芯片数据和基因组分析结果表明ERD7的表达在BL处理和ABA处理时发生上调［20-22］.施加GA使ERD7的表达量下调，而同时施加放线酮(cycloheximide)和地塞米松(dexamethasone)使GA信号通路的负调控因子DELLA家族中RGA的含量提高后，ERD7的表达量上调［23］.但ERD7的表达不受IAA 处理的影响［20］.

BKI1作为BR信号通路中一个重要的组成成分，BKI1通过亚细胞定位改变与BES1竞争性结合14-3-3等机制来调节BR信号通路.对于BKI1自身的调节目前研究主要集中于BRI1对BKI1的磷酸化，BKI1是否还受到其他蛋白的调控是一个值得探索的新课题.为了研究BKI1自身的调控机制，我们使用BKI1作为诱饵蛋白，通过酵母双杂交筛选拟南芥cDNA文库，发现了新的与BKI1相互作用蛋白—ERD7，它们的互作通过半体内pull-down的方法得到进一步验证.在细胞学上，我们证明BKI1与ERD7能够共定位在细胞膜和细胞质上.

1 材料与方法

1.1 材料

拟南芥(Arabidopsis thaliana)，烟草(Nicotiana benthamiana)，转基因拟南芥BKI1-FLAG，大肠杆菌克隆菌株Escherichia coli DH5α和表达菌株E.coli BL21(DE3)，酵母菌株Saccharomy cescerevisiae AH109和Y187，根癌农杆菌菌株Agrobacterium tumefaciens GV3101，酵母表达载体pGBKT7和pGADT7;烟草中瞬时表达载体pCAMBIA-2302和pCAMBIA-mCherry，大肠杆菌中蛋白表达载体pGEX4T-1均由本实验室保存.

植物生长培养基(1/2 MS培养基):2.2 g/L MS粉，0.8% 琼脂粉，pH5.6～6.0，向其中添加80μg/mL Kanamycin可用于抗性筛选.大肠杆菌完全培养基:LB 1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化钠，向其中添加100μg/mL Kanamycin或100μg/mL Ampicillin可用于抗性筛选.酵母培养基YPDA:2%蛋白胨，2%葡萄糖，1%酵母提取物，30μg/mL Adenine.酵母营养缺陷型培养基(SD-):0.67%无氨基酵母氮源，2%葡萄糖，5.5 g/L dropout mix(-His、-Trp、-Leu、-Ade)，根据需要加入 20 μg/mL His、Trp、Leu或Ade选择不同缺陷型菌株.向以上细菌培养基加入1%琼脂粉、酵母培养基加入2%琼脂粉配制相应固体培养基.

1.2 方法

1.2.1 酵母双杂交筛选

将BKI1构建到酵母表达载体pGBKT7中，转化进入AH109菌株.从Clontech购买了拟南芥cDNA文库(Clontech Cat.No.630487)，该文库cDNA由拟南芥的幼苗、花、芽、花粉、荚果、叶片、茎等11个组织中提取的mRNA逆转录而来.将cDNA文库转化进入Y187酵母菌株中，AH109菌株和Y187菌株杂交，在酵母SD/-Leu-Trp，SD/-His-Leu-Trp和SD/-Ade-His-Leu-Trp缺陷型营养培养基上进行阳性克隆筛选.

1.2.2 基因和蛋白质序列分析

在TAIR网站(http:∥www.arabidopsis.org/)查找拟南芥基因序列及结构，并在 NCBI网站(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)上查找 ERD7在其他物种中的同源基因序列，在 Mobyle网站(http:∥mobyle.pasteur.fr/)进行序列比对.在 PRED 网站(http:∥bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)对ERD7蛋白质二级结构进行预测，在SMART网站(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)进行蛋白质结构域预测.

1.2.3 GST-ERD7融合蛋白的体外表达及纯化

37℃过夜培养大肠杆菌表达菌株4 mL，然后再在250 mL培养基中扩大培养至OD600=1.0左右，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导，25℃培养5 h，收菌，向菌体中加入GST蛋白结合缓冲液20 mL，将菌体悬浮混匀，加入溶菌酶1 mg/mL，混匀后冰上放置30 min.超声破碎15 min，超声条件为超声5 s停12 s.超声结束后，12 000 r/min，4℃离心10 min，取上清.重复离心一次.根据收集到的菌体的量取适量的GST琼脂糖珠子，加入1 mL GST结合缓冲液，混匀后，1 000 r/min，4℃，离心3 min.重复3次.将蛋白上清液加入活化后的GST珠子中，4℃结合2～3 h.1 000 r/min，4℃，离心3 min，去上清.用结合缓冲液洗GST珠子5～6次，去上清.加入GST洗脱缓冲液400μL，4℃洗脱1 h，离心取上清，即为纯化后的GST融合蛋白.分装后-80℃保存.

1.2.4 半体内GST pull-down分析

将结合有GST融合蛋白的琼脂糖珠子悬浮在100μL GST结合缓冲液中备用.取2 g植物材料，在液氮中研磨，加入植物活性蛋白提取缓冲液1 mL，4℃静音混匀30 min.12 000 r/min，10 min离心，取上清.将悬浮着结合GST融合蛋白的珠子加入植物蛋白液中，静音混匀2 h.1 000 r/min离心，去上清，重复3次.加入40μL的1×SDS上样缓冲液，95℃变性5 min，取上清，进行SDS-PAGE电泳，通过Western blot使用Anti-Flag抗体检测植物材料中目标蛋白.

1.2.5 在烟草叶片细胞中瞬时表达蛋白及蛋白定位观察

构建植物表达载体pCAMBIA-2302-BKI1，pCAMBIA-ERD7-mCherry，同时转化进入烟草叶片下表皮细胞，使之同时表达BKI1-GFP蛋白和ERD7-mCherry蛋白.用荧光共聚焦显微镜Laser Scanning Confocal Microscope分别观察GFP和mCherry荧光蛋白的信号，对BKI1和ERD7蛋白进行亚细胞定位.

2 结果与分析

2.1 BKI1相互作用蛋白的筛选

为了寻找BR信号通路的新的组分，我们通过酵母双杂交方法筛选与BKI1相互作用的蛋白.BKI1基因全长序列被构建进入pGBKT7载体上，在酿酒酵母中表达融合DNA结合结构域(Binding Domain，BD)的BD-BKI1融合蛋白，形成诱饵蛋白，转化进入AH109酵母菌株中.

通过酵母双杂交筛选拟南芥cDNA文库，我们获得了298个能在SD/-His-Leu-Trp筛选培养基上生长的独立单菌落，其中136个能在SD/-Ade-His-Leu-Trp筛选培养上继续生长.利用菌落PCR的方法，克隆得到每个单菌落中包含的拟南芥cDNA序列，并测序分析.进一步将测序结果与拟南芥全基因组进行比对，发现其中26个单菌落中包含的序列在拟南芥基因组的读码框中编码蛋白质.选择其中与BD-BKI1相互作用最强的第32号单克隆对应的cDNA进行进一步研究.

从32号单克隆中扩增的核酸序列PCR产物与Tair数据库中发表的AT2G17840基因核酸序列相似，32号基因编码了AT2G17840基因中的第1～244个氨基酸残基.这表明AT2G17840基因编码的蛋白质N端与BKI1相互作用.进一步检测了全长ERD7蛋白与BKI1之间的相互作用(图1).

2.2 ERD7基因和蛋白序列分析

根据TAIR网站上的信息，ERD7基因序列全长1 359 bp，由4个外显子和3个内含子组成.编码了452个氨基酸残基构成的蛋白质，分子质量约为49 ku，等电点为5.079.使用ERD7蛋白质序列与NCBI数据库中不同物种间的序列进行比对分析，我们发现ERD7是一个在植物中特异表达的基因.ERD7与双子叶植物蓖麻(Ricinus communis)、大豆(Glycine max)的ERD7序列的相似性分别为69%和66%，与单子叶植物玉米(Zea mays)和水稻(Oryza sativa Japonica Group)的相似性均为46%，ERD7在低等植物小立碗藓(Physcomitrella patens subsp.Patens)中也有同源基因，它们的相似性为37%(图2).

图1 酵母双杂交筛选获得与BKI1相互作用的ERD7Fig.1 ERD7 was obtained by yeast two hybrid screening

通过Position Specific Iterated PRED对拟南芥ERD7蛋白的二维结构预测发现，ERD7蛋白有2个低复杂度区域(Low Complex Region)，一个富含β折叠的区域，一个富含α-螺旋的区域.通过SMART预测发现，ERD7蛋白包含一个衰老结构域(Senescence Domain，PF06911)，这个结构域由约450个氨基酸残基组成，最早发现于萱草(Hemerocallishybrid).萱草的花瓣存在一种有遗传基础的程序，在开花约24 h以内，细胞会出现衰老和死亡，人们认为在这个过程中表达产生的衰老相关蛋白与这个过程有重要关系［24］.衰老结构域还在许多Spartin蛋白中被发现，这可能表明它在胞内转运、微管的动态平衡方面发挥作用［25］.

图2 ERD7序列的比对分析Fig.2 Alignment analysis of ERD7

2.3 全长ERD7和BKI1在酵母中的相互作用验证

在酵母双杂交筛选中我们获悉了ERD7的N端与BKI1相互作用，为了验证全长ERD7与BKI1的相互作用关系，我们首先使用PCR方法从拟南芥总cDNA中扩增获得全长ERD7基因，并克隆到pGADT7载体上，使之在酵母中表达ERD7与激活结构域(Activation Domain，AD)融合的AD-ERD7重组蛋白.进行酵母双杂交实验.如图3所示，在酵母中，全长AD-ERD7与BD-BKI1能够生长于SD/-His-Leu-Trp的酵母缺陷培养基上，而AD与BD-BKI1和AD-ERD7与BD对照组不能生长，因此，结果说明AD-ERD7与BDBKI1能够在酵母中发生稳定的相互作用.

2.4 ERD7与BKI1在植物体内的相互作用验证

将全长ERD7基因克隆到原核表达载体pGEX4T-1上，在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达ERD7与谷胱甘肽S-转移酶(Gultathione STransferases，GST)融合的重组蛋白GST-ERD7.经过纯化，如图4(a)所示，我们得到约74 ku的蛋白条带，这与预测的ERD7蛋白的分子质量相似.

提取BKI1-FLAG过表达转基因植株的总蛋白，与珠子相连的纯化后GST-ERD7或GST蛋白分别与BKI1-FLAG转基因植株蛋白提取液共孵育，洗去非特异性结合蛋白.最后，使用FLAG抗体在Western blot中检测与GST-ERD7或GST特异性结合的蛋白.结果表明FLAG抗体在与GST-ERD7孵育的样品中检测到与提取液中一致的BKI1-FLAG条带，而与GST蛋白孵育的样品中没有杂交条带.这一结果说明在半体内环境下，ERD7与BKI1能够发生相互作用(图4(b)).

图4 ERD7蛋白的表达和半体内pull-down分析Fig.4 Protein purification of recombinant GST-ERD7 and semi-in-vivo pull-down assay

2.5 ERD7的亚细胞定位及与BKI1的共定位

为了在细胞学水平研究在植物体内ERD7与BKI1是否具有相似的亚细胞定位，我们首先构建了红色荧光蛋白mCherry与ERD7的C端融合为mCherry-ERD7和绿色荧光蛋白GFP与BKI1的C端融合为BKI1-GFP的植物表达载体，并分别转入农杆菌，将它们共同转染烟草细胞，我们通过共聚焦显微镜观察发现，mCherry-ERD7的荧光信号能够在细胞膜和细胞质中被检测，BKI1-GFP蛋白也在细胞膜和细胞质中表达.将两个蛋白信号叠加发现mCherry-ERD7和BKI1-GFP蛋白在细胞质和细胞膜上能够共定位(图5).说明两者在体内发挥功能的场所是一致的，在细胞水平上说明mCherry-ERD7和BKI1-GFP可能发生相互作用.

图5 ERD7与BKI1在烟草细胞中的的亚细胞定位Fig.5 Sub-cellular localization of ERD7 and BKI1 in tobacco cell

3 讨论

本研究通过酵母双杂交筛选发现ERD7与BKI1之间的相互作用，对于拓展BKI1的调控机制及探寻BR信号途径的新成分有重要作用.BR含量低时，BKI1主要定位于细胞膜上抑制BR信号通路，BR与BRI1结合后，BKI1从细胞膜上解离，进入细胞质并发挥新的正调控功能.ERD7蛋白与BKI1有共同的亚细胞定位，说明ERD7很可能在BKI1的定位变化过程中起到调控作用.与BKI1类似，ERD7在拟南芥全株广谱表达(e-FP Browser，数据未出示)，这可能适应于它通过调节BKI1来影响BR信号转导，进而调控拟南芥的生长发育.其中，在荚果和种子中ERD7的表达量较高，说明ERD7对于荚果和种子的发育可能起到重要作用.BKI1过表达植株表现出荚果角向下的表型［10］，是BR信号中其他突变体所不具有的特征，ERD7在荚果中的高表达暗示着ERD7很可能参与到BKI1调控荚果角的发育这一过程中.ERD7包含有一个衰老结构域，该结构域在多种植物中被报道与衰老相关［26-28］，在衰老过程中表达上调.BR的合成突变体和受体突变体均表现为衰老延迟，说明BR信号起着促进拟南芥衰老的作用［2，29］.因此，ERD7与BR信号通路元件在调节植物的衰老过程方面具有相似性.

植物通过复杂的网络系统来适应环境，包括激素的合成和运输，大量相关基因的表达调控等.BR信号在植物对环境胁迫的反应中起着重要作用，如干旱、高盐等［30］.BR信号对环境胁迫的反应还往往是通过与其他植物激素的相互作用，如ABA、GA、乙烯、水杨酸等实现的［31-33］.ERD7的表达受到多种环境胁迫的影响，干旱、冷害、强光、及高盐逆境因子都能诱导其表达，表明ERD7在提高植物的抗逆性上有广泛的作用.ERD7的表达还受到BL和ABA的诱导以及GA的抑制.ERD7在拟南芥中广泛表达，对多种逆境和植物激素响应，与BR对拟南芥的生长发育的调控有极大相关性，ERD7与BKI1相互作用的发现对探索ERD7对BKI1的调控及对BR信号转导通路的影响有重要意义.

［1］Yang C J，Zhang C，Lu Y N，et al.The mechanisms of brassinosteroids'action:From signal transduction to plant development［J］.Molecular plant，2011，4(4):588-600.

［2］Li J，Chory J.A putative leucine-rich repeat receptor kinase involved in brassinosteroid signal transduction［J］.Cell，1997，90(5):929-938.

［3］Friedrichsen D M，Joazeiro CA P，Li J，et al.Brassinosteroid-insensitive-1 is a ubiquitously expressed leucinerich repeat receptor serine/threonine kinase［J］.Plant Physiology，2000，123(4):1247-1256.

［4］Wang X，Goshe M B，Soderblom E J，et al.Identification and functional analysis of in vivo phosphorylation sites of the Arabidopsis BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE1 receptor kinase［J］.The Plant Cell，2005，17(6):1685-1703.

［5］Oh M H，Wang X，Kota U，et al.Tyrosine phosphorylation of the BRI1 receptor kinase emerges as a component of brassinosteroid signaling in Arabidopsis［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2009，106(2):658-663.

［6］He Z，Wang Z Y，Li J，et al.Perception of brassinosteroids by the extracellular domain of the receptor kinase BRI1［J］.Science Signaling，2000，288(5475):2360.

［7］Wang X，Li X，Meisenhelder J，et al.Autoregulation and homodimerization are involved in the activation of the plant steroid receptor BRI1［J］.Developmental Cell，2005，8(6):855-865.

［8］Nam K H，Li J.BRI1/BAK1，a receptor kinase pair mediating brassinosteroid signaling［J］.Cell，2002，110(2):203.

［9］Li J.Brassinosteroids signal through two receptor-like kinases［J］.Current Opinion in Plant Biology，2003，6(5):494-499.

［10］Wang X，Chory J.Brassinosteroids regulate dissociation of BKI1，a negative regulator of BRI1 signaling，from the plasma membrane［J］.Science Signaling，2006，313(5790):1118.

［11］Jaillais Y，Hothorn M，Belkhadir Y，et al.Tyrosine phosphorylation controls brassinosteroid receptor activation by triggering membrane release of its kinase inhibitor［J］.Science Signaling，2011，25(3):232.

［12］Wang H，Yang C，Zhang C，et al.Dual role of BKI1 and 14-3-3s in brassinosteroid signaling to link receptor with transcription factors［J］.Developmental Cell，2011，21(5):825-834.

［13］Guan Y，Wang H，Wang X.Identification and preliminary study of the minimum motif for BKI1 interacting with BRI1［J］.J Fudan Univ，2011，50(3):320-327.

［14］Kiyosue T，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.Cloning of cDNAs for genes that are early-responsive to dehydration stress(ERDs)in Arabidopsis thaliana L.:Identification of three ERDs as HSPcognate genes［J］.Plant Molecular Biology，1994，25(5):791-798.

［15］Seki M，Narusaka M，Ishida J，et al.Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsis genes under drought，cold and high-salinity stresses using a full-length cDNA microarray［J］.The Plant Journal，2002，31(3):279-292.

［16］Kimura M，Yamamoto Y Y，Seki M，et al.Identification of Arabidopsis genes regulated by high light-stress using cDNA microarray［J］.Photochemistry and Photobiology，2003，77(2):226-233.

［17］Oono Y，Seki M，Satou M，et al.Monitoring expression profiles of Arabidopsis genes during cold acclimation and deacclimation using DNA microarrays［J］.Functional＆ Integrative Genomics，2006，6(3):212-234.

［18］Abercrombie J，Halfhill M，Ranjan P，et al.Transcriptional responses of Arabidopsis thaliana plants to As(V)stress［J］.BMC Plant Biology，2008，8(1):87.

［19］Veyres N，Danon A，Aono M，et al.The Arabidopsis sweetie mutant is affected in carbohydrate metabolism and defective in the control of growth，development and senescence［J］.The Plant Journal，2008，55(4):665-686.

［20］Goda H，Sawa S，Asami T，et al.Comprehensive comparison of auxin-regulated and brassinosteroid-regulated genes in Arabidopsis［J］.Plant Physiology，2004，134(4):1555-1573.

［21］Sánchez J P，Duque P，Chua N H.ABA activates ADPR cyclase and cADPR induces a subset of ABA-responsive genes in Arabidopsis［J］.The Plant Journal，2004，38(3):381-395.

［22］Mizuno T，Yamashino T.Comparative transcriptome of diurnally oscillating genes and hormone-responsive genes in Arabidopsis thaliana:Insight into circadian clock-controlled daily responses to common ambient stresses in plants［J］.Plant and Cell Physiology，2008，49(3):481-487.

［23］Hou X，Hu W W，Shen L，et al.Global identification of DELLA target genes during Arabidopsis flower development［J］.Plant Physiology，2008，147(3):1126-1142.

［24］Panavas T，Pikula A，Reid P D，et al.Identification of senescence-associated genes from daylily petals［J］.Plant Molecular Biology，1999，40(2):237-248.

［25］Ciccarelli F D，Proukakis C，Patel H，et al.The identification of a conserved domain in both spartin and spastin，mutated in hereditary spastic paraplegia［J］.Genomics，2003，81(4):437-441.

［26］Smart C M，Hosken S E，Thomas H，et al.The timing of maize leaf senescence and characterization of senescence-related cDNAs［J］.Physiologia Plantarum，1995，93(4):673-682.

［27］John I，Hackett R，Cooper W，et al.Cloning and characterization of tomato leaf senescence-related cDNAs［J］.Plant Molecular Biology，1997，33(4):641-651.

［28］Buchanan-Wollaston V，Ainsworth C.Leaf senescence in Brassica napus:Cloning of senescence related genes by subtractive hybridisation［J］.Plant Molecular Biology，1997，33(5):821-834.

［29］Choe S，Dilkes B P，Gregory B D，et al.The Arabidopsis dwarf1 mutant is defective in the conversion of 24-methylenecholesterol to campesterol in brassinosteroid biosynthesis［J］.Plant Physiology，1999，119(3):897-908.

［30］Kagale S，Divi U K，Krochko J E，et al.Brassinosteroid confers tolerance in Arabidopsis thaliana and Brassica napus to a range of abiotic stresses［J］.Planta，2007，225(2):353-364.

［31］Zhang S，Cai Z，Wang X.The primary signaling outputs of brassinosteroids are regulated by abscisic acid signaling［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2009，106(11):4543-4548.

［32］Wang L，Wang Z，Xu Y，et al.OsGSR1 is involved in crosstalk between gibberellins and brassinosteroids in rice［J］.The Plant Journal，2009，57(3):498-510.

［33］Divi U K，Rahman T，Krishna P.Brassinosteroid-mediated stress tolerance in Arabidopsis shows interactions with abscisic acid，ethylene and salicylic acid pathways［J］.BMCPlant Biology，2010，10(1):151.