火棘中水溶性多糖的提取及测定

楚红英+陈志冉+李瑜

摘要:采用超声波辅助提取技术,通过单因素试验和L9(34)正交试验,探讨了提取条件对火棘(Pyracantha fortuneana)中多糖类物质提取率的影响,采用苯酚-硫酸法测定火棘中多糖含量,以葡萄糖作为标准对照物,在482 nm处测定吸光度,并计算其含量。结果表明,在火棘多糖超声波最佳提取工艺条件下(提取剂pH为7,30 ℃下按液料比30∶1提取40 min),火棘果中多糖提取率达2.148%。

关键词:火棘(Pyracantha fortuneana);多糖;提取;苯酚-硫酸法

中图分类号:TQ351;TQ91文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)10-2408-04

Extraction and Determination of Polysaccharides in Pyracantha fortuneana

CHU Hong-ying1,CHEN Zhi-ran1,LI Yu2

(1.Department of Environment and Chemical Engineering,Yellow River Conservancy Technical Institute,Kaifeng 475004,Henan,China;2.Department of Urology,Zhengzhou Peoples Hospital Yi He Hospital,Zhengzhou 450047,Henan,China)

Abstract:The conditions of ultrasound-assisted extracting polysaccharides from Pyracantha fortuneana were studied with single factor analysis and L9(34) orthogonal experiment. The content of polysaccharides in Pyracantha fortuneana was determined by phenol-H2SO4 colorimetry at 482 nm with glucose as the standard. The results showed that the optimal conditions of ultrasonic extracting polysaccharides from Pyracantha fortuneana were 30 ℃ for 40 min with pH 7 and the best ratio of liquid (mL) to solid(g) was 30∶1.Under the optimal conditions,the yield of polysaccharides from Pyracantha fortuneana was 2.148%.

Key words: Pyracantha fortuneana;polysaccharides;extraction;phenol-H2SO4 colorimetry

基金项目:黄河水利职业技术学院科研基金项目(2013KYJS012)

火棘(Pyracantha fortuneana)又名救兵粮、救命粮、火把果、赤阳子等,为蔷薇科火棘属常绿灌木或小乔木[1]。火棘不仅具有观赏价值,而且还具有食用和药用价值,火棘中含有β-谷甾醇、北美圣草素、芦丁、芒苷、异槲皮苷、槲皮素和超氧化物歧化酶等活性成分[2,3]。研究表明,火棘具有抗氧化、增强免疫力、利胆、助消化、降血脂和抗疲劳等作用,根、皮、叶均具有生津止渴、清热解毒、收敛止泻之功效,其果可用于疗疮毒、治阴虚、止泻痢等[4],火棘还具有美白作用[5]。作为植物光合作用的初生产物,多糖不仅是多数天然产物合成的初始原料,也是动植物维持生命不可缺少的一类化合物[6]。目前,多糖提取主要包括:热水浸提、热熔、超声、微波、酶解等方法[7-10],测定方法主要包括3,5-二硝基水杨酸盐比色法、Somogyi-Nelson法、地衣酚-硫酸法、苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法等方法[11]。本试验采用超声法提取,苯酚-硫酸法测定火棘中的水溶性多糖,旨在为开发利用火棘资源提供参考。

1材料与方法

1.1材料

火棘样品采自黄河水利职业技术学院;所用试剂均为分析纯试剂,去离子水。

1.2仪器

PB1502-L型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);ZRD-8210型电热风干燥箱(上海智诚分析仪器制造有限公司);TU-1810紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司);HC-3018R型高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司);DJZ型粉碎机(常州市日宏佳尔特粉体设备有限公司)。

1.3方法

1.3.1样品预处理取新鲜火棘,去除杂物,洗净,自然风干,50 ℃烘干至恒重,粉碎,密封保存于棕色瓶中备用。

1.3.2样品提取称取1.000 0 g火棘粉,按一定比例加入去离子水,在超声条件下提取:超声功率为500 W,趁热抽滤,定容至50 mL,取出5 mL,用无水乙醇定容至25 mL,混匀,静置过夜后,以10 000 r/min离心5 min,弃上清液,沉淀用80%(V/V)乙醇洗涤2次,加入去离子水,加热溶解,定容至25 mL,即为待测样品溶液。

1.3.3标准样品溶液的配制称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖标准品0.050 0 g于100 mL容量瓶中,去离子水定容,摇匀,得0.500 g/L的标准溶液。

1.3.4最大吸收波长的选择用移液管准确吸取一定量的标准溶液于10 mL具塞比色管中,用去离子水定容至2 mL,加入0.6%(m/V,下同)苯酚0.5 mL,浓硫酸定容,将样品于紫外-可见分光光度计上扫描。

1.3.5试样中多糖含量的测定 吸取待测试样1.00 mL于10 mL比色管中,按上述1.3.4步骤操作,测定其吸光度值,代入线性回归方程算出对应试样中多糖的含量。

2结果与讨论

2.1检测波长和标准曲线

样品在450~550 nm的紫外-可见吸收图谱见图1,由图1可知,样品在482 nm处有最大吸收,故选择482 nm为检测波长。

分别移取0~1.00 mL系列体积的葡萄糖标准溶液于10 mL比色管中,去离子水定容至2 mL,加入0.6%苯酚0.5 mL,用浓硫酸定容至刻度,冷却至室温,以试剂空白溶液为参比,测定482 nm处吸光度,以葡萄糖质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,如图2所示,得线性回归方程:A=0.033 7 C+0.080 1,r=0.998 8,在0~50 mg/L之间呈良好线性关系。

2.2条件优化

以11月火棘果为分析试样,研究pH、液料比、提取时间和提取温度对多糖提取率的影响。

2.2.1pH对多糖提取率的影响 称取6份样品粉末,每份1.000 0 g,液料比为30∶1(mL∶g,下同),60 ℃提取20 min,分析不同pH的提取剂提取效果,结果见图3。由图3可知,提取剂pH在5~7范围,多糖提取率与pH呈负相关,pH大于7时,对多糖提取影响不大。故当提取剂pH为5时,多糖提取率较高。

2.2.2液料比对多糖提取率的影响 称取6份样品粉末,每份1.000 0 g,提取剂pH为5,60 ℃提取20 min,不同液料比对提取率的影响见图4。由图4可知,当液料比为30∶1时,多糖提取率最高。当液料比较小时,物料与提取液接触不充分,导致提取率较低;而当液料比为30∶1至60∶1时,提取率较稳定。

2.2.3提取时间对多糖提取率的影响称取6份样品粉末,每份1.000 0 g,液料比30∶1,提取剂pH为5,60 ℃超声不同时间对多糖提取率的影响见图5。由图5可知,随着超声时间的增加,多糖提取率升高。当提取温度超过30 min后,提取率趋向稳定。

2.2.4提取温度对多糖提取率的影响 称取6份样品粉末,每份1.000 0 g,液料比为30∶1,提取剂pH为5,超声时间20 ℃,不同温度对多糖提取率的影响见图6。由图6可知,在30 ℃和80 ℃下,多糖提取率较高,30~40 ℃时,多糖提取率与温度呈负相关,40~70 ℃时,多糖提取率与温度呈正相关。

2.3正交试验结果

为全面考察多糖提取的工艺参数,根据单因素试验结果及相关文献[7-10],以提取温度、pH、提取时间及液料比4个因素进行正交试验,采用L9(34)正交试验方法以确定提取最佳条件,正交试验设计及结果见表1。

由各因素极差分析可知,对多糖提取率的影响大小次序是A、B、C、D,即提取温度>pH>提取时间>液料比。最佳方案是A1B3C2D2,即优化条件为:液料比30∶1,在pH为7的条件下,30 ℃超声提取40 min。

但该方案在正交试验中并没有出现,为了确定上述方案是否为最佳方案,按A1B3C2D2条件对火棘果样品进行分析,结果见表2。从表2中可知,该方案可行。

2.4实际样品分析结果

在上述A1B3C2D2条件下,对9~12月份火棘的叶和果进行了多糖的提取与测定,其对应含量如表3所示。

结果表明,9~12月,火棘叶中多糖含量逐渐变小,而火棘果中多糖从9~10月是逐渐增加的,从11月以后火棘果中的多糖呈下降趋势。总的来说,火棘叶中的多糖大于火棘果中多糖。可以看出火棘中含有丰富的多糖。

2.5精密度和稳定性分析

吸取正交试验中的3号样品平行测定5次,结果表明,测定结果的RSD=2.16%,表明仪器精密良好;每隔10 min测定3号样品,连续测定6次,其RSD为0.97%,表明样品溶液在1 h内稳定。

3结论

本试验以火棘为研究对象,探讨了火棘中多糖的提取及含量测定。试验结果表明,各因素的主次关系为:提取温度>提取剂酸碱度>提取时间>液料比;最佳提取工艺为:提取温度30 ℃、pH为7,提取时间40 min、液料比30∶1,采用紫外-可见分光光度计测定火棘中多糖的含量。火棘叶中的多糖含量高于果实,火棘叶中的多糖在9~12月间逐渐变小,而果中多糖在9~10月间增加,11~12月间下降。相关结果将为火棘资源开发利用提供参考。

参考文献:

[1] 曾令贵,钟露苗.火棘的研究现状与应用概况[J].中国药事,2009,23(10):1021-1023.

[2] TETSUO K,JEFFREY B H,JOHN E,et al.Dibenzofuran phytoalexins from the sapwood tissue of photinia,pyracantha and cratategus species[J].Phytochemistry,1995,39(5):1033-1037.

[3] DAI Y,ZHOU G X,KURIHARA H,et al.Fortuneanosides G-l,dibenzofuran glycosides from the fruit of Pyracantha fortuneana[J].Chem Pharm Bull,2008,56(4):439-442.

[4] 蒋利华,熊远福,李霞,等.野生火棘果有效成分研究进展[J].中国野生植物资源,2007,26(2):8-10.

[5] 何蓉蓉,李维熙,李怡芳,等.火棘果实提取物的美白作用[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(2):184-188.

[6] 吴立军.天然药物化学[M].北京:人民卫生出版社,1988.

[7] 黄妮,熊双丽,卢飞.绵麦冬多糖的分离纯化及自由基清除活性[J].林产化学与工业,2011,31(1):68-72.

[8] 李润丰,常学东,陈雪娜.板栗多糖提取工艺的研究[J].林产化学与工业,2011,31(2):96-100.

[9] 庄永亮,孙丽平,尚小丽.红托竹荪菌盖多糖的提取及抗氧化能力的研究[J].林产化学与工业,2011,31(3):45-49.

[10] 杨胜利,刘敏,钱俊青.香菇多糖酶催化酯化技术及其抗病毒活性研究[J].生物质化学工程,2009,43(4):29-32.

[11] 刘丹.对多糖测定方法的探讨[J].四川文理学院学报,2008, 18(2):48-50.

2.2.2液料比对多糖提取率的影响 称取6份样品粉末,每份1.000 0 g,提取剂pH为5,60 ℃提取20 min,不同液料比对提取率的影响见图4。由图4可知,当液料比为30∶1时,多糖提取率最高。当液料比较小时,物料与提取液接触不充分,导致提取率较低;而当液料比为30∶1至60∶1时,提取率较稳定。

2.2.3提取时间对多糖提取率的影响称取6份样品粉末,每份1.000 0 g,液料比30∶1,提取剂pH为5,60 ℃超声不同时间对多糖提取率的影响见图5。由图5可知,随着超声时间的增加,多糖提取率升高。当提取温度超过30 min后,提取率趋向稳定。

2.2.4提取温度对多糖提取率的影响 称取6份样品粉末,每份1.000 0 g,液料比为30∶1,提取剂pH为5,超声时间20 ℃,不同温度对多糖提取率的影响见图6。由图6可知,在30 ℃和80 ℃下,多糖提取率较高,30~40 ℃时,多糖提取率与温度呈负相关,40~70 ℃时,多糖提取率与温度呈正相关。

2.3正交试验结果

为全面考察多糖提取的工艺参数,根据单因素试验结果及相关文献[7-10],以提取温度、pH、提取时间及液料比4个因素进行正交试验,采用L9(34)正交试验方法以确定提取最佳条件,正交试验设计及结果见表1。

由各因素极差分析可知,对多糖提取率的影响大小次序是A、B、C、D,即提取温度>pH>提取时间>液料比。最佳方案是A1B3C2D2,即优化条件为:液料比30∶1,在pH为7的条件下,30 ℃超声提取40 min。

但该方案在正交试验中并没有出现,为了确定上述方案是否为最佳方案,按A1B3C2D2条件对火棘果样品进行分析,结果见表2。从表2中可知,该方案可行。

2.4实际样品分析结果

在上述A1B3C2D2条件下,对9~12月份火棘的叶和果进行了多糖的提取与测定,其对应含量如表3所示。

结果表明,9~12月,火棘叶中多糖含量逐渐变小,而火棘果中多糖从9~10月是逐渐增加的,从11月以后火棘果中的多糖呈下降趋势。总的来说,火棘叶中的多糖大于火棘果中多糖。可以看出火棘中含有丰富的多糖。

2.5精密度和稳定性分析

吸取正交试验中的3号样品平行测定5次,结果表明,测定结果的RSD=2.16%,表明仪器精密良好;每隔10 min测定3号样品,连续测定6次,其RSD为0.97%,表明样品溶液在1 h内稳定。

3结论

本试验以火棘为研究对象,探讨了火棘中多糖的提取及含量测定。试验结果表明,各因素的主次关系为:提取温度>提取剂酸碱度>提取时间>液料比;最佳提取工艺为:提取温度30 ℃、pH为7,提取时间40 min、液料比30∶1,采用紫外-可见分光光度计测定火棘中多糖的含量。火棘叶中的多糖含量高于果实,火棘叶中的多糖在9~12月间逐渐变小,而果中多糖在9~10月间增加,11~12月间下降。相关结果将为火棘资源开发利用提供参考。

参考文献:

[1] 曾令贵,钟露苗.火棘的研究现状与应用概况[J].中国药事,2009,23(10):1021-1023.

[2] TETSUO K,JEFFREY B H,JOHN E,et al.Dibenzofuran phytoalexins from the sapwood tissue of photinia,pyracantha and cratategus species[J].Phytochemistry,1995,39(5):1033-1037.

[3] DAI Y,ZHOU G X,KURIHARA H,et al.Fortuneanosides G-l,dibenzofuran glycosides from the fruit of Pyracantha fortuneana[J].Chem Pharm Bull,2008,56(4):439-442.

[4] 蒋利华,熊远福,李霞,等.野生火棘果有效成分研究进展[J].中国野生植物资源,2007,26(2):8-10.

[5] 何蓉蓉,李维熙,李怡芳,等.火棘果实提取物的美白作用[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(2):184-188.

[6] 吴立军.天然药物化学[M].北京:人民卫生出版社,1988.

[7] 黄妮,熊双丽,卢飞.绵麦冬多糖的分离纯化及自由基清除活性[J].林产化学与工业,2011,31(1):68-72.

[8] 李润丰,常学东,陈雪娜.板栗多糖提取工艺的研究[J].林产化学与工业,2011,31(2):96-100.

[9] 庄永亮,孙丽平,尚小丽.红托竹荪菌盖多糖的提取及抗氧化能力的研究[J].林产化学与工业,2011,31(3):45-49.

[10] 杨胜利,刘敏,钱俊青.香菇多糖酶催化酯化技术及其抗病毒活性研究[J].生物质化学工程,2009,43(4):29-32.

[11] 刘丹.对多糖测定方法的探讨[J].四川文理学院学报,2008, 18(2):48-50.

2.2.2液料比对多糖提取率的影响 称取6份样品粉末,每份1.000 0 g,提取剂pH为5,60 ℃提取20 min,不同液料比对提取率的影响见图4。由图4可知,当液料比为30∶1时,多糖提取率最高。当液料比较小时,物料与提取液接触不充分,导致提取率较低;而当液料比为30∶1至60∶1时,提取率较稳定。

2.2.3提取时间对多糖提取率的影响称取6份样品粉末,每份1.000 0 g,液料比30∶1,提取剂pH为5,60 ℃超声不同时间对多糖提取率的影响见图5。由图5可知,随着超声时间的增加,多糖提取率升高。当提取温度超过30 min后,提取率趋向稳定。

2.2.4提取温度对多糖提取率的影响 称取6份样品粉末,每份1.000 0 g,液料比为30∶1,提取剂pH为5,超声时间20 ℃,不同温度对多糖提取率的影响见图6。由图6可知,在30 ℃和80 ℃下,多糖提取率较高,30~40 ℃时,多糖提取率与温度呈负相关,40~70 ℃时,多糖提取率与温度呈正相关。

2.3正交试验结果

为全面考察多糖提取的工艺参数,根据单因素试验结果及相关文献[7-10],以提取温度、pH、提取时间及液料比4个因素进行正交试验,采用L9(34)正交试验方法以确定提取最佳条件,正交试验设计及结果见表1。

由各因素极差分析可知,对多糖提取率的影响大小次序是A、B、C、D,即提取温度>pH>提取时间>液料比。最佳方案是A1B3C2D2,即优化条件为:液料比30∶1,在pH为7的条件下,30 ℃超声提取40 min。

但该方案在正交试验中并没有出现,为了确定上述方案是否为最佳方案,按A1B3C2D2条件对火棘果样品进行分析,结果见表2。从表2中可知,该方案可行。

2.4实际样品分析结果

在上述A1B3C2D2条件下,对9~12月份火棘的叶和果进行了多糖的提取与测定,其对应含量如表3所示。

结果表明,9~12月,火棘叶中多糖含量逐渐变小,而火棘果中多糖从9~10月是逐渐增加的,从11月以后火棘果中的多糖呈下降趋势。总的来说,火棘叶中的多糖大于火棘果中多糖。可以看出火棘中含有丰富的多糖。

2.5精密度和稳定性分析

吸取正交试验中的3号样品平行测定5次,结果表明,测定结果的RSD=2.16%,表明仪器精密良好;每隔10 min测定3号样品,连续测定6次,其RSD为0.97%,表明样品溶液在1 h内稳定。

3结论

本试验以火棘为研究对象,探讨了火棘中多糖的提取及含量测定。试验结果表明,各因素的主次关系为:提取温度>提取剂酸碱度>提取时间>液料比;最佳提取工艺为:提取温度30 ℃、pH为7,提取时间40 min、液料比30∶1,采用紫外-可见分光光度计测定火棘中多糖的含量。火棘叶中的多糖含量高于果实,火棘叶中的多糖在9~12月间逐渐变小,而果中多糖在9~10月间增加,11~12月间下降。相关结果将为火棘资源开发利用提供参考。

参考文献:

[1] 曾令贵,钟露苗.火棘的研究现状与应用概况[J].中国药事,2009,23(10):1021-1023.

[2] TETSUO K,JEFFREY B H,JOHN E,et al.Dibenzofuran phytoalexins from the sapwood tissue of photinia,pyracantha and cratategus species[J].Phytochemistry,1995,39(5):1033-1037.

[3] DAI Y,ZHOU G X,KURIHARA H,et al.Fortuneanosides G-l,dibenzofuran glycosides from the fruit of Pyracantha fortuneana[J].Chem Pharm Bull,2008,56(4):439-442.

[4] 蒋利华,熊远福,李霞,等.野生火棘果有效成分研究进展[J].中国野生植物资源,2007,26(2):8-10.

[5] 何蓉蓉,李维熙,李怡芳,等.火棘果实提取物的美白作用[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(2):184-188.

[6] 吴立军.天然药物化学[M].北京:人民卫生出版社,1988.

[7] 黄妮,熊双丽,卢飞.绵麦冬多糖的分离纯化及自由基清除活性[J].林产化学与工业,2011,31(1):68-72.

[8] 李润丰,常学东,陈雪娜.板栗多糖提取工艺的研究[J].林产化学与工业,2011,31(2):96-100.

[9] 庄永亮,孙丽平,尚小丽.红托竹荪菌盖多糖的提取及抗氧化能力的研究[J].林产化学与工业,2011,31(3):45-49.

[10] 杨胜利,刘敏,钱俊青.香菇多糖酶催化酯化技术及其抗病毒活性研究[J].生物质化学工程,2009,43(4):29-32.

[11] 刘丹.对多糖测定方法的探讨[J].四川文理学院学报,2008, 18(2):48-50.