氧化石墨烯增强鲁米诺-过氧化氢化学发光测定姜黄素

刘 霜，张建霞，2，刘希东

(1.重庆文理学院材料与化工学院，重庆 永川 402160;2.重庆市綦江实验中学，重庆 綦江 401420)

石墨烯(Graphene)是Novoselov、Geim等人于2004年首次发现的，它是一种由sp2杂化碳原子紧密堆积的单原子层结构的二维原子晶体，是构成包括石墨、碳纳米管、富勒烯等在内的碳的同素异形体的基本组成单元，属新型二维平面纳米材料.从Novoselov首次报道人工制备的石墨烯以来，研究发现石墨烯表现在力、热、电、光等物理学方面的优异性能，使之成为10年来物理学、化学、材料科学等多个领域的国际研究前沿和热点［1］. 氧化石墨烯(Graphene Oxide，简称GO)是石墨烯重要的含氧衍生物，它和石墨烯相比，在六角环形片状体碳原子上引入了羰基、羟基、羧基、环氧基等含氧极性官能团.由于氧化石墨烯表面带有的官能团具有亲水性，因此，具有一定的润湿性能和表面活性［2］，在水中可以较好地分散.Wang Ying［3］等研究发现，GO 能增强CdTe量子点的电化学发光信号，并已将其应用于谷胱甘肽的电化学发光分析中;Dong Xiaoli［4］等利用GO具有表面积大和吸附作用强等特点，将GO作为固体萃取吸附剂应用于角鲨烯的测定，建立了角鲨烯的时间分辨质谱测定方法，实现了GO在固相中的分离与检测;冯亚娟［2］等基于GO和辣根过氧化物酶的相互作用将其应用于过氧化氢的测定;Song Yujun［5］等研究发现，氧化石墨烯本身也具有过氧化物酶的功能，能催化葡萄糖反应生成过氧化氢，由此建立了血液和果汁中葡萄糖的间接测定方法.虽然GO在分析测定方面已有了一定的应用研究，但总体上GO在分析化学领域的应用还处于探索阶段，特别是将GO应用于光分析方面的研究较少，因此探究其在光分析化学中的应用具有一定的价值和研究前景.

化学发光分析法已广泛应用于药物分析、环境分析、材料分析和临床分析等领域［6］.在碱性介质中，Luminol能被H2O2氧化产生稳定的化学发光信号，已成为应用最广泛的化学发光体系之一.文献报道，许多纳米材料对H2O2-Luminol化学发光体系的发光具有增强作用［7-8］.GO特殊的单原子层片层结构决定了其在电学、光学方面的特殊性质［3，5］.本文采用化学发光分析法，研究GO对H2O2-Luminol发光体系的影响，发现GO在H2O2-Luminol体系中起着催化作用，能明显增敏该发光反应.

姜黄素(Curcumin)(结构如图1所示)是姜科姜黄属植物中的有效成分之一，从药用植物姜黄中提取的姜黄素，除姜黄素外还包括少量去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素.研究表明:姜黄素［9，10］具有抗氧化、抗炎等多种生物活性，对肿瘤的发生发展等多个阶段均有抑制作用，作为天然色素的姜黄素色泽稳定，毒性极低，已广泛应用于食品添加剂和医药等领域［11］，同时，也有研究表明其具有一定的细胞毒性［12］，因此评价姜黄属植物中姜黄素的含量具有实际意义.姜黄素的测定方法主要有电化学法［13］、毛细管电泳法［14］、光分析法［15］、化学发光法［16］、高效液相色谱法［17］等.其中，化学发光法灵敏度高，检测限低而被广泛应用.本文通过实验研究发现姜黄素对GO增强H2O2-Luminol化学发光具有明显的抑制作用，结合流动注射技术，建立了流动注射-化学发光法定量测定姜黄素含量的分析方法.实验表明:该方法用于市售姜黄中姜黄素的测定，结果令人满意.

图1 姜黄素的结构式

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

RFL-1型超微弱化学发光/生物发光检测仪、IFIS-C型智能流动注射进样器、IFFL-A型多功能化学发光检测器(西安瑞迈分析仪器有限公司).

Luminol储备溶液(1.0×10-2mol/L):准确称取0.443 0 g Luminol(Fluka)，溶于0.1 mol/L的NaOH溶液中，用0.1 mol/L的NaOH溶液定容于250 mL棕色容量瓶中，4℃冰箱保存，使用时用0.1 mol/L的NaOH溶液稀释至所需浓度.

H2O2溶液(0.75 mol/L):用30﹪H2O2溶液配制，现配现用.

姜黄素标准储备溶液(1.00×10-3mol/L):准确称取0.092 0 g姜黄素(国药集团化学试剂有限公司)，溶于75﹪乙醇溶液中，用75﹪乙醇溶液定容于250 mL棕色容量瓶中，4℃冰箱保存，操作溶液用75﹪乙醇溶液逐级稀释储备溶液，现配现用.

实验试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水.

1.2 实验方法及装置

如图2所示流路装置，二次蒸馏水作载流，样品溶液通过八通阀随载流溶液注入到GO与H2O2的混合溶液中，经三通混合后再注入到Luminol溶液，混合液在流通池中发生氧化反应，反应产生的化学发光信号由RFL-1型超微弱化学发光/生物发光检测仪检测，以相对发光强度△I定量.

图2 流动注射化学发光分析流程图

2 结果与讨论

2.1 发光体系和流路参数的选择

H2O2在碱性条件下能氧化Luminol产生化学发光，实验发现GO对Luminol-H2O2化学发光反应具有很强的增敏作用，而姜黄素对GOLuminol-H2O2三元体系的化学发光强度具有明显的抑制作用.当选择流动注射系统如下流路参数时:流通管内径0.8 mm，采样环长度15 cm，阀池距16 cm，Luminol浓度2.0×10-3mol/L，H2O2浓度0.75 mol/L，GO 浓度 0.8 mg/mL，试验了流路参数对反应体系的相对化学发光强度的影响.结果表明，体系的相对化学发光强度随泵速的增加而增大，该反应体系属快速化学发光体系，选择高泵速有利于提高体系的灵敏度.但泵速提高，试剂消耗也显著增加.综合考虑各种因素，调整P1、P2的泵速均为85 r/min，体系可获得最大信噪比.

2.2 NaOH浓度和Luminol浓度的影响

Luminol能溶于NaOH溶液，而且Luminol的化学发光反应在碱性条件下能顺利进行，其化学发光强度大而稳定，NaOH浓度明显影响体系的化学发光强度.实验考察了用浓度为0.01～1.0 mol/L的NaOH溶液配制的Luminol溶液对体系相对化学发光强度的影响，结果表明，当NaOH溶液浓度为0.1 mol/L时，体系的相对化学发光强度最大.因此，实验用0.1 mol/L NaOH溶液配制Luminol溶液.实验考察了1.0×10-5～1.0×10-2mol/L浓度范围内的Luminol溶液对化学发光强度的影响.如图3所示，Luminol在低浓度时，体系的相对化学发光强度较低，微小增大Luminol浓度，体系的相对化学发光强度迅速增强，当Luminol浓度为2.0×10-3mol/L时，体系的相对化学发光强度达到最大;当其浓度超过2.0×10-3mol/L时，体系的背景发光强度也迅速增大，相对化学发光强度缓慢降低，实验选择Luminol的浓度为2.0×10-3mol/L.

图3 Luminol浓度的影响

2.3 过氧化氢浓度的影响

在GO-Luminol-H2O2三元化学发光体系中，作为氧化剂的H2O2，其浓度将会影响体系的化学发光强度，实验考察了0.1～2.0 mol/L浓度范围的H2O2溶液对体系化学发光强度的影响.结果表明，体系的化学发光强度随H2O2浓度的增加而增强，当H2O2的浓度为0.75 mol/L时，体系的化学发光强度最大，随后伴随H2O2浓度的增加，基线漂移不稳定，体系的相对化学发光强度缓慢降低，实验选择H2O2浓度为0.75 mol/L.

2.4 GO浓度的影响

在GO-Luminol-H2O2化学发光体系中，GO作为反应体系的催化剂，不同的GO浓度，对体系的影响程度也不同.当姜黄素浓度为1.0×10-5mol/L、H2O2浓度为 0.75 mol/L、Luminol浓度为2.0×10-3mol/L时，实验考察了GO在0.15～1.50 mg/mL浓度范围内对体系的相对化学发光强度的影响.如图4所示，体系的相对化学发光强度随GO浓度的增加而增强，随后缓慢减弱，实验选择GO浓度为0.8 mg/mL.

图4 GO浓度的影响

2.5 校准曲线、检出限和精密度实验

按照实验方法和在优化的实验条件下，测定了不同浓度的姜黄素对体系相对发光强度的影响.如图5所示，姜黄素在5×10-8～1.0×10-5mol/L浓度范围内与相对化学发光强度呈良好的线性关系，线性方程为△I=0.1636c+106.027，R2=0.9989(c的数量级及单位为10-8mol/L);以11次空白测定值标准偏差的3倍计算方法的检出限(3σ)为6.3×10-9mol/L.对浓度为5×10-6mol/L的姜黄素平行测定9次，相对标准偏差为2.6﹪.

2.6 共存物质的干扰

文献报道［18］，姜黄的活性成分除姜黄素外，还含有糖类、挥发性油类及微量金属元素等.在优化的实验条件下，试验了一些常见物质对测定姜黄素的影响.结果表明，50倍量的葡萄糖、蔗糖、淀粉、草酸、柠檬酸，5 倍量的 Zn2+、Al3+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Co2+，等倍量的 Cu2+、Fe3+对于5.0 ×10-6mol/L浓度的姜黄素的测定无干扰.

图5 校准曲线

2.7 样品的测定

取姜黄药材适量，粉碎，准确称取0.200 g姜黄粉末，用50 mL乙醇(75﹪)超声提取30 min，过滤;取残渣加入50 mL乙醇(75﹪)中再次超声提取30 min，过滤，合并两次滤液用乙醇(75﹪)定容至250 mL，得待测样品溶液，由于姜黄素极易被氧化，因此姜黄素的标准溶液和样品溶液均应避光于4℃冰箱中保存.

取一定量的样品溶液，用乙醇(75﹪)溶液适度稀释，按照实验方法测定姜黄素总量，同时做样品回收率实验，结果与文献［15］的紫外分光光度法结果基本一致.

表1 姜黄样品中姜黄素总量的测定结果

3 结论

在碱性条件下，H2O2氧化Luminol产生化学发光，GO能显著增强Luminol化学发光反应.实验发现姜黄素对GO-Luminol-H2O2化学发光体系有抑制作用，GO能使体系的相对化学发光强度明显降低，结合流动注射分析技术，建立了姜黄素的化学发光分析测定新方法.此法用于药用姜黄中总姜黄素的测定，结果与文献［15］报道的紫外分光光度法测定结果基本一致.

［1］Novoselov K S，Geim A K，Morozov S V，et al.Electric field effect inatomically thin carbon films［J］.Science，2004，306:666-669.

［2］冯亚娟，魏玉萍，赵晓慧，等.氧化石墨烯在辣根过氧化物酶传感器中的应用研究［J］.化学研究与应用，2011，23(4):444-450.

［3］Wang Y，Lu J，Tang L H，et al.Graphene oxide amplified electrogenerated chemiluminescence of quantum dots and its selective sensing for glutathione from Thiol-containing compounds［J］.Analytical Chemistry，2009，81(23):9710-9715.

［4］Dong X L，Cheng J S，Li J H，et al.Graphene as a novel matrix for the analysis of small molecules by MALDI-TOF MS［J］.Analytical Chemistry，2010，82(14):6208-6214.

［5］Song Y J，Qu K G，Zhao C，et al.Graphene oxide:intrinsic peroxidase catalytic activity and its application to glucose detection［J］.Advanced Materials，2010，22(19):2206-2210.

［6］石文兵，张小丹，何少慧，等.化学发光法快速筛选纳米颗粒模拟酶［J］.中国科学:化学，2013，43:1591-1598.

［7］Li S F，Zhang X M，Du W X，et al.Chemiluminescence reactions of a luminol system catalyzed by ZnO nanoparticles［J］.Journal of Physical Chemistry C，2008，113(3):1046-1051.

［8］Xie J X，Huang Y M.Co3O4nanoparticles-enhanced luminol chemiluminescence and its application in H2O2and glucose detection［J］.Analytical Methods，2011，3(5):1149-1155.

［9］王玉玲，吴振，张喜轩.姜黄素类化合物的抗肿瘤活性［J］.中国医科大学学报，2006，35(4):380-381.

［10］梁广，田吉来，邵丽丽，等.姜黄素的构效关系及以其为先导物的抗肿瘤化合物研究进展［J］.化学通报，2008(2):110-117.

［11］肖小河，苏中武，乔传卓，等.姜黄属药用植物研究进展［J］.中草药，1997，28(2):114-119.

［12］Chan W H，Wu H Y，Chang W H.Dosage effects of curcumin on cell death types in a human osteoblast cell line［J］.Food and Chemical Toxicology，2006，44(8):1362-1371.

［13］程司，刘智广，曹云新，等.姜黄素的化学测定的新方法［J］.第四军医大学学报，2000，21(2):241-243.

［14］袁凯龙，翁前锋，张宏颖，等.毛细管电泳法测定尿中的姜黄素［J］.色谱，2004，22(6):609-612.

［15］刘红星，陈福北，黄初升，等.紫外分光光度法在姜黄素类化合物提取中的应用［J］.广西师范学院学报:自然科学版，2008，25(3):68-72.

［16］刘爱林，蔡怡珊，陈伟.反向流动注射化学发光法测定姜黄素［J］. 分析试验室，2010，29(12):8-11.

［17］Jayaprakasha G K，Jagan Mohan Rao L，Sakariah K K.Improved HPLC method for the determination of curcumin，demethoxy curcumin，and bis demethoxy curcumin［J］.Journal of Agricultural Food Chemistry，2002，50(13):3668-3672.

［18］葛跃伟，高慧敏，王智民.姜黄属药用植物研究进展［J］.中国中药杂志，2007，32(23):2461-2467.