不同脂肪酸对体外培养的瘤胃微生物活力和蛋白质含量的影响

皮 宇 经语佳 王梦芝 王洪荣 王 慧 黄 蔚

(扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009)

油脂是反刍动物高温或高产时期良好的能量补充物，但其中脂肪酸的不饱和键对瘤胃微生物具有一定的负效应，这种负效应有区系特异性(如不饱和脂肪酸对细菌有负效应，饱和或不饱和脂肪酸对原虫均有负效应)，可影响微生物的活力和其正常的发酵活动［1-4］。如果能充分利用微生物对脂肪酸响应的差异性，那么添加适量脂肪酸可稳定瘤胃发酵，提高微生物蛋白质产量，提高能量和氮素的利用效率，为宿主提供能量与微生物蛋白质［5-6］，对宿主的营养代谢、机体健康、生产性能等都至关重要。有研究表明随着添加植物油脂中的不饱和脂肪酸的不饱和度的增加，体外瘤胃发酵的甲烷生成量显著降低［7］。本实验室前期对微生物微循环的研究发现，适量比例和结构的油脂能够抑制原虫吞噬细菌的微生物再循环，增加细菌生物量［8］。但目前对于脂肪酸影响瘤胃微生物的系统研究尚不多见。为此，本研究选用6种不同脂肪酸，探讨其对体外培养的瘤胃微生物活力和蛋白质含量的影响，以期为脂肪酸的体内研究及油脂影响瘤胃微生态的机理研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲养管理

试验选取3头1.5周岁、体重为(29.4±2.7)kg、装有永久性瘤胃瘘管的山羊，分单舍饲养，以玉米+豆粕+羊草为常规饲粮，每日按体重的2.5%干物质量供料，07:00和19:00等量饲喂，自由饮水。

1.2 试验设计与培养底物

试验设6个分别添加3%的硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸的试验组和1个添加3%棕榈酸钙的对照组，每组3个重复。另外设1个无底物的空白对照组。培养底物组成见表1。

1.3 体外培养与样品采集

体外培养参照Menke等［9］的方法。培养试验开始前3 h内配制好人工唾液，并利用自制的真空负压装置，在早饲前通过瘤胃瘘管分别从3只羊的瘤胃中采集500 mL瘤胃液，混合后经4层纱布过滤，装入保温瓶，通CO2，置于39℃水浴中保温待用。将配制好的培养液(人工唾液∶瘤胃液=2∶1)通入 CO2，39 ℃水浴预热。

按照试验设计准确称取1.95 g培养底物置于不同标号的三角瓶中，紫外灭菌30 min，再分别加入200 mL培养液，塞紧橡皮塞。通过进气管道通入CO2，39℃恒温水浴振荡培养。分别在培养开始后 0、3、6、9、12、18、24 h 即时测定 pH，并取样10 mL即刻分装于离心管中，保存于-20℃冰箱，用于氨氮浓度、总脱氢酶及转氨酶活性和微生物蛋白质含量的测定。

1.4 指标测定与方法

1.4.1 pH的测定

采用上海雷磁试验设备厂pHS-3C型pH计，测定前用pH=4.01和pH=6.88的标准缓冲液校正。

1.4.2 氨氮浓度和微生物蛋白质含量的测定

氨氮浓度参照冯宗慈等［10］的方法进行测定。参照Wang等［11］的方法进行微生物分离和蛋白质含量的测定。

1.4.3 总脱氢酶活性的测定

参考Humeyan等［12］的方法并改进。具体操作过程为:取100目尼龙布过滤的新鲜瘤胃液2 mL于试管中，加入0.2 mL 1.5%的氯化三苯四氮唑(TTC)，对照管先加入5 mL异丙醇。在厌氧条件下恒温水浴(38～39℃)10 min。然后在试验管中加入5 mL异丙醇终止反应。混合后，以4 000×g离心 10 min。上清液稀释 15倍，于UV-2401PC分光光度计在485 nm处比色测定吸光度(A485nm)。以38.5℃、pH 6.8条件下，每分钟引起测定液吸光度上升0.1的酶量定义为1个酶活单位。

1.4.4 转氨酶活性的测定

谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性分别采用谷草转氨酶和谷丙转氨酶微板法试剂盒测定，样品处理方法参照试剂盒说明书，采用美国MD-Spectra-Max M5台式酶标仪测定。试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.5 统计分析

数据用平均值±标准差表示，采用SPSS 16.0软件中compare mean的one-way ANOVA过程进行单因素方差分析，用Duncan氏法进行多重比较检验。

2 结果

2.1 不同脂肪酸对微生物活力的影响

由表2可知，各组总脱氢酶活性随采样时间的整体变化呈现先升高，后降低的趋势。各组总脱氢酶活性平均值顺序为:α-亚麻酸组＞亚油酸组＞油酸组＞二十碳五烯酸组＞花生四烯酸组＞硬脂酸组＞对照组，且α-亚麻酸组总脱氢酶活性在3～24 h培养过程中均高于其他试验组和对照组。

在各采样时间，3、6和9 h油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸(除9 h外)、二十碳五烯酸组总脱氢酶活性均显著高于对照组(P＜0.05)，3和9 h硬脂酸组和对照组之间差异不显著(P＞0.05)。12和18 h除花生四烯酸和硬脂酸组外，各试验组总脱氢酶活性均显著高于对照组(P＜0.05)，并以α-亚麻酸组最高。24 h亚油酸、α-亚麻酸组总脱氢酶活性均显著高于其他各组(P＜0.05)，油酸、硬脂酸组和对照组之间差异不显著(P＞0.05)，但均显著高于花生四烯酸和二十碳五烯酸组(P＜0.05)。

由表3可知，各组谷草转氨酶活性平均值顺序为:花生四烯酸组＞二十碳五烯酸组＞α-亚麻酸组＞亚油酸组＞油酸组＞对照组＞硬脂酸组，亚油酸、α-亚麻酸、二十碳五烯酸和花生四烯酸组之间差异不显著(P＞0.05)，但均显著高于对照组和硬脂酸组(P＜0.05)。

在各采样时间，除0 h外，油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸组谷草转氨酶活性均显著高于对照组和硬脂酸组(P＜0.05)。其中3和12 h以二十碳五烯酸组最高;6和9 h以花生四烯酸组最高，二十碳五烯酸、亚油酸、α-亚麻酸、油酸组依次降低，在各组间有显著性差异(P＜0.05)。

由表4可知，各组谷丙转氨酶活性平均值顺序为:花生四烯酸组＞二十碳五烯酸组＞α-亚麻酸组＞油酸组＞亚油酸组＞对照组＞硬脂酸组，其中花生四烯酸和二十碳五烯酸组显著高于其他各组(P＜0.05);油酸、亚油酸和α-亚麻酸组间差异不显著(P＞0.05)，但均显著高于对照组和硬脂酸组(P＜0.05)。

在各采样时间，除0和12 h外，油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸组谷丙转氨酶活性显著高于对照组和硬脂酸组(P＜0.05);硬脂酸组与对照组之间差异不显著(P＞0.05);除3、6、9 h外，其他采样时间以花生四烯酸组最高。

2.2 不同脂肪酸对瘤胃发酵参数的影响

由表5可知，各组的pH变化范围依次为6.53～6.68、6.55 ～6.67、6.54 ～6.70、6.55 ～6.68、6.56 ～6.70、6.55 ～6.68、6.55 ～6.68;体外发酵的pH整体变化范围在6.53～6.70，并且各组间均差异不显著(P＞0.05)。

在各采样时间，pH随采样时间的变化呈现先升高后降低，最后再上升的趋势，各组在3 h达到最大值，除了硬脂酸、亚油酸组外，其他组在12 h达到最小值。

表2 不同脂肪酸对总脱氢酶活性的影响Table 2 Effects of different fatty acids on activity of total dehydrogenase U/mL

表3 不同脂肪酸对谷草转氨酶活性的影响Table 3 Effects of different fatty acids on activity of glutamic-oxal(o)acetic transaminase IU/L

表4 不同脂肪酸对谷丙转氨酶活性的影响Table 4 Effects of different fatty acids on activity of glutamic-pyruvic transaminase IU/L

表5 不同脂肪酸对pH的影响Table 5 Effects of different fatty acids on pH

由表6可知，各组氨氮浓度随采样时间的整体变化呈现0～3 h快速上升、3 h达到一个峰值、3～9 h下降、9～24 h缓慢上升的趋势，在3～9 h亚油酸和α-亚麻酸组氨氮浓度下降较其他各组快。各组氨氮浓度平均值顺序为:对照组＞硬脂酸组＞二十碳五烯酸组＞花生四烯酸组＞油酸组＞亚油酸组＞α-亚麻酸组。

在各采样时间，3和6 h对照组和硬脂酸组氨氮浓度差异不显著(P＞0.05)，但均显著高于其他各试验组(P＜0.05)。9 h对照组和硬脂酸组氨氮浓度差异不显著(P＞0.05)，但均显著高于其他各试验组(P＜0.05);花生四烯酸和二十碳五烯酸组差异不显著(P＞0.05)，但均显著高于α-亚麻酸、亚油酸、油酸组(P＜0.05);α-亚麻酸组在此时间达到最低水平。12 h对照组和硬脂酸组氨氮浓度差异不显著(P＞0.05)，但均显著高于其他各试验组(P＜0.05);α-亚麻酸、亚油酸、二十碳五烯酸和花生四烯酸组差异不显著(P＞0.05)，但均显著高于油酸组(P＜0.05)。18 hα-亚麻酸组氨氮浓度显著低于其他各组(P＜0.05)。

表6 不同脂肪酸对氨氮浓度的影响Table 6 Effects of different fatty acids on concentration of NH3-N mg/dL

2.3 不同脂肪酸对瘤胃微生物蛋白质含量的影响

由表7可知，微生物蛋白质含量随采样时间的整体变化呈现0～3 h下降、3～9 h升高、9～24 h下降的趋势。各组微生物蛋白质含量平均值顺序为:α-亚麻酸组＞亚油酸组＞油酸组＞硬脂酸组＞对照组＞二十碳五烯酸组＞花生四烯酸组。

在各采样时间，0 h各组间微生物蛋白质含量差异不显著(P＞0.05)。3 h微生物蛋白质含量平均值顺序为:对照组＞硬脂酸组＞亚油酸组＞α-亚麻酸组＞二十碳五烯酸组＞油酸组＞花生四烯酸组，各组间差异显著(P＜0.05)。6 h微生物蛋白质含量平均值顺序为:α-亚麻酸组＞花生四烯酸组＞亚油酸组＞油酸组＞二十碳五烯酸组，各组间差异不显著(P＞0.05)，但均显著高于对照组和硬脂酸组(P＜0.05)。12 h微生物蛋白质含量平均值顺序为:α-亚麻酸组＞亚油酸组＞油酸组，均显著高于花生四烯酸、二十碳五烯酸、硬脂酸组和对照组(P＜0.05);花生四烯酸、二十碳五烯酸组显著低于对照组(P＜0.05)。18和24 h微生物蛋白质含量缓慢下降至各组最低值。

表7 不同脂肪酸对微生物蛋白质含量的影响Table 7 Effects of different fatty acids on microbial protein content mg/mL

3 讨论

3.1 不同脂肪酸对瘤胃微生物活力的影响

谷草转氨酶和谷丙转氨酶一般在胞内的活性远远高于胞外，但若细胞受损、胞膜破坏将导致胞外的酶活性上升。在本研究中，各组谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性随采样时间不断提高，其原因可能是在培养过程中随时间的延长微生物与代谢物不断积累，微生物细胞自溶导致细胞壁、细胞膜的破坏，从而导致上述酶的释放增加［13-14］。各不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸)组均显著高于对照组和硬脂酸组，并随着不饱和度的增加，变化幅度增大，可能是由于上述不饱和脂肪酸对原虫或细菌具有一定的负效应，而且不饱和程度越高其负效应越大所致［6］，其中不饱和度最高的二十碳五烯酸对细胞的破坏程度最大。

总脱氢酶活性能够直接反映微生物发酵时脱氢酶传递氢的能力，即整体微生物的活力［15］。本研究发现各组总脱氢酶活性随着采样时间的变化呈现增长的趋势，之后又有所下降，这与微生物的生长繁殖规律相一致，即微生物的培养过程中指数生长期后会进入稳定期、衰亡期而使微生物活力下降［16-17］。各不饱和脂肪酸组总脱氢酶活性均高于对照组，以α-亚麻酸组活性最高。表明一定比例的不饱和脂肪酸有一定的提高培养液微生物活力的效应。这可能是由于其游离脂肪酸的不饱和键会抑制原虫生长［7］，使其群体生物量减少，进而减少其对细菌的吞噬，通过区系生物量的消长，而最终可能改变微生物的生物总量及微生物总的活力所致［18］。而本试验添加3%的油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸，不饱和度依次增大，相当于100 mL培养液中添加水平 分 别 为 0.106、0.107、0.108、0.099、0.099 mmol，但试验结果显示处于中等水平的α-亚麻酸组总脱氢酶活性较其他组高，表明脂肪酸一定程度的不饱和度可以通过限制原虫生长而提高细菌的数量;而不饱和键数量较多的花生四烯酸和二十碳五烯酸可能是对原虫、细菌的负作用大于通过抑制原虫生长提高细菌数量的正向作用，也表明了该添加水平致使微生物细胞的损害程度较大，其适宜的添加水平有待进一步的研究。

3.2 不同脂肪酸对瘤胃微生物发酵参数的影响

pH是反映瘤胃发酵状态的一个重要指标并受诸多因素的影响［19-20］。瘤胃液pH的正常变化范围是5.5～7.5，适于微生物生长及其酶类正常的发酵活动。本研究的pH变化范围在6.53～6.70，变化不显著，处在正常范围内。与李凤学等［21］、宋志刚等［22］的有关添加 4%的油脂对培养液pH的影响不显著的研究结果相一致，也表明了添加3%的该6种脂肪酸对培养液pH没有显著的影响。

氨氮浓度可看作是微生物对含氮化合物的降解及其生长对氨固定利用的综合指示指标。本研究中各组的氨氮浓度基本处于微生物正常生长对氨氮浓度耐受的临界范围内。各组的氨氮浓度随采样时间呈上升趋势，并在3 h达到一个峰值，可能是微生物对底物中含氮化合物降解所致;而后氨氮浓度的下降则可能是微生物迅速繁殖对氨的利用所致。在培养9 h后氨氮浓度的回升，可能是由于体外培养装置的简易，微生物及其降解物不能外排，造成微生物自溶而额外释放的氨所致［16］。另外，在培养3～9 h，油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸组的氨氮浓度较对照组低，原因可能是不饱和脂肪酸对原虫的负作用抑制了原虫吞噬细菌的活力，进而提高了细菌的数量以及活力，加速对氨氮的利用合成菌体蛋白。随着油酸、亚油酸、α-亚麻酸不饱和度的增加，结果呈现出氨氮浓度在油酸、亚油酸、α-亚麻酸组依次降低的规律。α-亚麻酸的不饱和度高于花生四烯酸和二十碳五烯酸，但在培养3～9 h时，α-亚麻酸组氨氮浓度下降速度较花生四烯酸和二十碳五烯酸组快。这可能是因为上述的后2组脂肪酸过多的不饱和键影响了微生物的活力和其正常的发酵活动所致。

3.3 不同脂肪酸对瘤胃微生物蛋白质含量的影响

Dijkstra等［2］认为不饱和的长链脂肪酸对细菌有负作用，但无论其饱和与否对原虫都有负作用，并随不饱和程度的增加其效应加大，使其群体生物量减少，类群结构发生变化，进而抑制其吞噬细菌等活动，而表现为区系间生物量的消长变化［3］，最终可能改变微生物总量。本研究表明，各脂肪酸组的微生物蛋白质含量除花生四烯酸组都高于对照组，表明了脂肪酸对微生物蛋白质具有一定的调控作用。本试验中添加的油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸不饱和度依次增大，但试验结果显示处于中等水平的α-亚麻酸组微生物蛋白质含量较其他组高。这提示不饱和脂肪酸可调控微生物蛋白质含量，但存在着适宜的不饱和程度和一定的添加水平，不饱和程度过高或添加水平过高可能对原虫、细菌的负作用大于通过抑制原虫生长提高细菌数量的正向作用。这一结果与上述微生物活力的结果也有一定的一致性。

4 结论

本试验条件下，添加3%的不同脂肪酸对瘤胃微生物活力和微生物蛋白质含量具有一定的调控作用，且以α-亚麻酸效果较好。

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