用7.0 T 1H MR波谱对脑胶质瘤不同部位脑代谢特征的实验研究

易美芝，延根，张桂珊，耿宽，吴仁华

脑胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤。虽然先进的外科技术得以进一步发展，新颖的局部放射治疗和化疗不断涌现，脑胶质瘤复发率仍居高不下，最主要的原因还是胶质瘤的侵袭性生长模式[1]。恶性侵袭性脑胶质瘤具有从瘤体中心向瘤周脑组织浸润生长数厘米特性[2]。胶质瘤侵袭边界的识别能为临床对脑胶质瘤的评估和治疗提供重要的参考信息，而常规MR结构成像序列对肉眼无法识别瘤体以外的肿瘤细胞探测并不敏感。

MR波谱(MRS)是一项非侵袭性的检测脑代谢物变化手段，它能准确定量脑内主要代谢物浓度。据研究报道，不同脑代谢物的绝对浓度或代谢物之间比率能预测脑胶质瘤的级别、侵袭范围[3]及预后[4]情况。目前对脑胶质瘤代谢物MRS研究时感兴趣区主要是放在瘤体实质部分，但是实质部分以外其他部位，尤其是肿瘤周边组织代谢情况却很少给予分析，且对代谢物定量方面也仅仅局限于利用各代谢物间浓度比率。本实验目的是在7.0 T这一超高磁场下，利用MRS技术及LCModel后处理软件获得脑胶质瘤不同部位代谢物绝对浓度、分析其代谢特征。希望实验方法能为评断脑胶质瘤潜在边界提供有效的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 材料

雌性SD大鼠20只，购于汕 头大学医学院动物实验中心，体重250～300 g，随机等量分成2组，置于SPF级环境饲养。C6胶质瘤细 胞购于上海中科院 细胞库，在含有10%胎牛血清 的DMEM/F12的培养基，5% CO2、37 ℃细胞孵育箱中培养。Agilent 7.0 T (USA)动物专用MR扫描仪，以及与其匹配的直径160 mm表面线圈。立体定向仪购于中国RWD Life Science公司， Gd-DTPA购于中国北陆公司。

1.2 方法

(1)动物模型的制备：当C6细胞处于对数生长期时，将肿瘤细胞制成悬液，浓度为106/10 μl。用10%的水合氯醛(3.3 ml/kg)腹腔注射麻醉实验鼠后，在立体定向仪引导下，选定鼠脑右侧基底节区为进针靶点，具体坐标是：前囟前1 mm，矢状缝右3 mm，硬膜下6 mm，接种量为10 μl。细胞悬液注射速度要不超过1 μl/min，注射完毕后停针5 min，最后缓慢拔针，骨蜡封闭骨孔，缝合皮肤，切口消毒，重置于 SPF环境培养。(2)动物模型MR扫描：荷瘤大鼠及正常组大鼠于术后7 d行MRI和MRS检查，同样用10%的水合氯醛(3.3 ml/kg)腹腔注射麻醉实验室，取俯卧位固定于上，先后完成MRI常规平扫、1H MRS和MRI增强扫描，扫描均选用冠状位。MRI及MRS参数设定：T1WI选择SEMS序列，TR 350 ms，TE 最小，FOV 25 mm×25 mm，Average 8，Matrix 192×192。T2WI扫描选择FSEMS序列，TR 2500 ms，ESP 12 ms，Average 8，Matrix 192×192。MRS采集于T1、T2扫描以后，采用STEAM序列，TR 5000 ms，TE 60 ms，在3个层面T2WI上定位，Average 320次，FOV 3 mm×3 mm×3 mm，ROI分别放在肿瘤中心、肿瘤实体部分、肿瘤周边和对侧正常脑组织。定位，匀场及压水后得到原始波谱图像。再将原始波谱数据通过LCModel软件量化分析处理可以得到代谢物的绝对浓度。最后行Gd剂增强MRI，参数如上T1扫描。增强扫描是经尾静脉注入Gd-DTPA (1.2 ml/kg)后立即进行。(3)组织病理学检查：所有上述扫描序列完成后，将实验鼠处死，把实验鼠脑组织经石蜡包埋后切4 um薄片，HE染色。(4)统计学分析：最终波谱数据统计学分析应用SPSS 17.0软件。采用One-Way Anova检验，检验标准：双侧 ɑ=0.05，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 动物模型临床表现

种植肿瘤细胞7 d后SD大鼠活动量减少，饮水及摄食降低，毛发失去光泽，眼周淤血，逐渐出现偏瘫、昏迷直至死亡。

2.2 MRI表现

所有荷瘤鼠右侧基底节区见异常信号影，呈椭圆形膨胀性生长。T1WI上等、低信号，T2WI上等、高信号，边界欠清晰。瘤灶周边的脑组织与瘤体分界欠清，瘤灶周边脑组织与对侧正常脑组织在任何一层MRI上从肉眼上观察信号几乎无差异。Gd增强动态扫描病灶呈明显延迟强化(图1)。

2.3 MRS结果

行MRS扫描时，波谱数据通过LCModel和SPSS软件分析、统计，最终得到了一系列有规律性的结果。

(1)从肿瘤中心、肿瘤实体部分、肿瘤周边组织到对侧正常脑组织，NAA和tCr浓度呈逐渐上升趋势：肿瘤周边组织与对侧正常脑组织间NAA浓度比较无统计学差异(P=0.996)，其他各组间NAA浓度两两比较有统计学差异(P=0)；肿瘤周边组织与对侧正常脑组织间 tCr浓度比较也无统计学差异(P=0.053)，其他各组间tCr浓度两两比较有统计学差异(其中肿瘤实体部分与肿瘤周边组织间P=0.012，其余各组间P值均=0)。(2)从肿瘤中心到对侧正常脑组织，Ala浓度呈逐渐下降趋势，仅肿瘤实体部分与对侧正常脑组织间Ala浓度有统计学差异性(P=0.016)，其他各组间Ala浓度均无统计学差异性。(3)Tau和Ins浓度在肿瘤周边组织达到最低：肿瘤中心、肿瘤实体部分和对侧正常脑组织与肿瘤周边组织间Tau浓度均有统计学意义(P值分别为0.019、0.016、0.009)；肿瘤中心、肿瘤实体部 分和对侧正常脑组织与肿瘤周边组织间Ins浓度均有统计学意义(P值分别为0.036、0、0.018)。Glx浓度在肿瘤周边达到最高：肿瘤中心与对侧正常脑组织、肿瘤中心与肿瘤周边组织、肿瘤实体部分与肿瘤周边组织间Glx浓度有统计学差异性(P=0)，肿瘤实体部分、肿瘤周边组织与对侧正常脑组织间Glx浓度有统计学差异性(P值分别为0.003、0.012)，肿瘤实体部分与肿瘤中心组织间Glx浓度有统计学差异性(P=0.002)。Cho、Lip、Lac浓度在各组间并无明显规律可循(图2)。

2.4 病理学结果

HE染色低倍镜下观察见肿瘤无包膜，肿瘤细胞呈巢状排列，瘤内常见出血及坏死灶，高倍镜下观察， 瘤细胞形态多样，核大、多核、核质深染、异形性高(图3)。

3 讨论

3.1 检测胶质瘤侵袭性的新技术

虽然病理学检查是诊断和评估脑胶质瘤的金标准，但在临床工作中，神经影像学仍然是检测脑胶质瘤发生和发展的重要手段，尤其当肿瘤生长在脑功能区域时。许多前期研究发现，胶质瘤瘤体周边那些看似正常的脑组织内其实包含了自由水，具有侵袭的肿瘤细胞，小胶质细胞及反应性胶质细胞[5]。常规MRI成像序列因其有较高的分辨率及信噪比能清晰显示胶质瘤的形态、提供丰富的解剖学信息，但在显示瘤体潜在浸润边界上尚有一定局限性。MRS同样是以MRI基本原理为基础，从分子学角度监测脑组织的代谢情况，能反映出瘤周脑组织受肿瘤细胞侵袭情况，继而可以判断肿瘤的分级、增殖及预后。

3.2 脑胶质瘤灶不同部位代谢物MRS特征及分析

图2 载瘤模型4个不同部位氢质子MRS图。A：肿瘤中心部分；B：肿瘤实体部分；C：肿瘤周边部分；D：对侧正常脑组织Fig.2 Representative proton MR spectroscopy spectra from 7.0 T in four different areas.A: Localized proton spectrum of the tumour center.B: Localized proton spectrum of the tumour solid part.C: Localized proton spectrum of the peritumoral normal-appearing tissue.D: Localized proton spectrum of the contralateral white matter.

NAA的化学位移是在2.0 ppm处，它被视为是神经元的标志，许多疾病如：脑白质营养不良、多发硬化及恶性脑肿瘤都会引起一定程度NAA下降[6]，其含量可以单独或联合Cho来鉴别肿瘤及非肿瘤组织[7]。NAA的浓度也与肿瘤级别和患者年龄呈反比。本实验病理切片显示肿瘤中心区域有明显坏死及出血灶，故其内NAA含量比肿瘤实体部分要低，在常规MRI下肉眼无法识别肿瘤周边组织信号的改变，而肿瘤周边组织内NAA浓度却低于对侧正常脑组织，虽然浓度差异无统计学意义，但仍在一定程度上提示肿瘤周边组织结构可能存在的破坏。从对侧正常脑组织到肿瘤中心部分，NAA浓度的梯度变化，可以反映正常神经元被肿 瘤细胞取代这一过程。tCr峰在3.02 ppm处可以探测到，tCr由Cr和Pcr共同组成的，被认为是能量代谢标记物，目前其含量一直被大多数人认为是比较稳定的[8]，但仍有部分研究者还是发现在一些肿瘤，尤其是高级别胶质瘤中，其浓度会有相应程度的减低，并被认为导致其浓度减低原因是肿瘤代谢率增高了，但是其具体的特异性生化机制目前暂未知。从对侧正常脑组织到肿瘤中心tCr浓度逐渐减低的趋势提示相应部位组织代谢率可能在逐步增加。

Ala共振峰在1.47 ppm处，它的变化与Lac相似，依据TE的长短显示为正立或倒置的双峰，有时与Lac峰很难鉴别，与其他脑肿瘤相比较，Ala在脑膜瘤中的出现频率会稍高一点[9]。从肿瘤中心到对侧正常脑组织，Ala浓度呈逐渐减低趋势，这个结果与Ziegler等[10]的研究结果相符合。Lac和Ala是能量代谢的中间产物，故这两种物质与肿瘤代谢密切相关。同Lac一样，肿瘤内增高的糖酵解可以解释增高的Ala浓度。

图3 荷瘤模型病理学结果。A：肉眼所见病理切片横断面，病灶中心可见明显出血及坏死；B：HE染色，可见多个大的深染的核异性细胞，肿瘤细胞聚集呈巢样生长Fig.3 Pathology photos of a rat C6 glioma model.A: Globular brain-tumor can obviously be seen in naked eye with a central hemorrhage and necrosis.B: HE staining confi rms tumors specimen in all tested tissues.The tumor cells are spindle-shaped into density, with large and deep stained nuclear, which arranges into whirlpool nest in the tumor.

本实验结果显示Tau和Ins浓度在肿瘤周边组织达到最低，Glx浓度在肿瘤周边组织达到最高，且这三种物质的浓度在肿瘤周边与其他各组之间均有统计学差异性，笔者认为这三种物质浓度的改变在判别肿瘤的潜在边界具有相对特异性。Tau是一种氨基磺酸，在3.3 ppm处能够被探测到其共振峰，发育中的小脑和小脑皮质层中这种物质的含量很丰富。Hekmatyar等[11]研究发现模拟人类脑成神经管细胞瘤的荷瘤鼠瘤灶内Tau 浓度显著高于对照组正常鼠，其实验结果表明Tau与肿瘤的侵袭性行为密切相关。Opstad等[12]研究发现患有成神经管细胞瘤的幼儿脑病灶内Tau浓度明显升高，并证实Tau是一种可以鉴别不同种类脑肿瘤的特殊代谢物。这些发现奠定了Tau和其他某些代谢物一样可被纳入肿瘤侵袭性及分类标志的基础。Ins是在氢质子波谱内可探测到的含量最丰富的代谢物之一。它是一种与细胞膜的更新和细胞磷脂层结构有关的物质[13]，因此任何一种形式的细胞膜更新的加快或细胞膜磷脂层的破坏都可以导致Ins浓度的升高。体外实验发现星形胶质细胞内有高浓度的Ins[14]，并且还证实了它是同胶质细胞的激活相关联。在脑胶质瘤内升高的Ins可以反映星形胶质细胞密度的增加，同时在一定程度上提示肿瘤细胞膜的更新和细胞增殖的加快，故也是一种潜在的MRS诊断标记物。近些年来，研究者对Glx的研究逐年增多，它起源于2.35 ppm和3.76 ppm处的谱峰，是由Glutamate和Glutamine组成。Glx浓度的变化被认为是一种反映肿瘤代谢旁 路变化的指标。至于为什么Tau、Ins、Glx在瘤周脑组织浓度有如此特殊的分布还有待于后期实验的进一步研究。 Cho、Lip、Lac浓度在本实验各组间无明显规律可循，故本实验结果无法对其作出有价值的分析。

3.3 实验设计优势与不足

本实验最大优势在于利用7.0 T超高场动物专用MR扫描仪采集相关实验数据，它比临床上常用的MR扫描仪器场强更高、匀场更均匀，配有两路射频通道、四路接收通道、多种体线圈和表面线圈。该扫描仪具有高达100 μm的空间分辨率和300 mT/rn的梯度磁场强度，组织分辨率高，高场强MR成像系统则提高了空间分辨率且缩短了成像时间，对研究组织器官微观结构，以及其生化代谢过程等有十分重要的作用[15]。实验不足之处是MRS数据采集时用到的STEAM序列，STEAM序列是最常用的单体素波谱采集序列，其与多体素波谱序列明显不同之处是采集目标组织的空间涵盖量，多体素波谱序列能在同一时间内多部位采集波谱数据，后期实验若能使用多体素波谱序列将能进一步提高实验准确性及效率。

综上所述，本研究证实，在7.0 T高场MRI下，能够获得实验小鼠脑胶质瘤的小ROI的有效的1H波谱。1H MRS技术是一种获取脑胶质瘤不同部位代谢特征、判断其潜在受侵范围的重 要手段。同时，Tau、Ins和Glx可能对判断脑胶质瘤潜在瘤体边界提供重要的参考信息。

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