不同生境中密蒙花黄酮类化合物质量分数的差异1)

陈兰英 权秋梅 秦 芳 黎云祥

(西南野生动植物资源保护教育部重点实验室(西华师范大学)，南充，637000)

密蒙花(Buddleja officinalis Maxim)为马钱科(Loganiaceae)醉鱼草属(Buddleja)半阴生灌木植物的干燥花及花序，为传统中药，具有清热养肝、明目退翳之功效[1－2]。现代化学成分与药理活性研究表明，总黄酮、苯乙醇苷类、三萜类是密蒙花中重要的次生代谢产物，蒙花苷为黄酮类化合物的主要成分[3－7]。许多研究表明密蒙花中木犀草素及芹菜素类化合物虽然质量分数较低，但其质量分数与蒙花苷成一定的组成关系，且木犀草素和芹菜素具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌消炎等作用[8－12];黄色素也是密蒙花黄酮类化合物的活性成分，作为添加剂用于食品着色，笔者提取黄色素的主要成分蒙花苷做药理及传粉方面的研究[13]。目前对密蒙花的干燥花及花序的黄酮类化合物质量分数及其药理作用方面，有专家进行了广泛的研究，并证明它们具有较高的药用价值[14－16];而对生态学方面的研究相对较少，特别是生境异质性对密蒙花不同部位次生代谢产物质量分数的影响还未见相关的报道。笔者选择3种不同的生境，对密蒙花不同部位的蒙花苷、木犀草素和芹菜素质量分数及其环境因子进行了分析，探讨生境异质性和环境因子对密蒙花主要黄酮类成分质量分数的影响，为科学合理利用野生密蒙花资源、规范化栽培及提高产量提供理论依据。

1 试验地概况

研究地位于四川盆地中部南充市与广安市交界地金城山森林公园，北纬 30°45'，东经 106°28'，地处北亚热带，属于亚热带暖气候区，季风气候明显，四季分明，热量丰富，年均气温17.5℃，年均降水量在1100 mm 左右[17]。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

黄酮类化合物质量分数的测定采用美国Agilen公司1100型高相液相色谱仪(含脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器)，美国Thermo NanoDrop ND－200C微量紫外分光光度计，德国Sartorius公司BP211D型电子天平，德国Eppendorf Research移液器，Millipope公司MillQ型纯水仪，上海亚荣SHZ－Ⅲ循环水真空泵，Autoscience过滤器。对照品蒙花苷(批号MUST－12081203，纯度≥98%，HPLC)、木犀草素(批号 MUST－12100401，纯度≥98%，HPLC(高效液相色谱法))、芹菜素(批号MUST－12050505，纯度≥98%，HPLC)购于成都松青生物科技有限公司，甲醇为色谱纯(Merck公司)，水为高纯水，其余试剂为分析纯。样地环境因子的测定采用法国KIMO温度湿度计、美国3413F－Field Scout光照计等进行。

2.2 样地设置及取样

在2012年4月密蒙花的繁殖期，选取林内、林隙和林缘3种不同海拔生境的密蒙花种群设置样方及取样。实验中利用温度湿度计、光照计测定各个种群中的温度、湿度和相对光照(林下光照强度与裸地光照强度之比)，为避免环境因子测定误差，3个种群同时测定并重复测5次。每种生境选择5～10株成龄密蒙花个体，对各个部位分别采样，其中花是按照不同的生长发育阶段即花蕾期和盛花期分别采样。将野外采集的密蒙花样品于室内阴凉通风处干燥，制成粉末过40目筛后备用。

2.3 不同生境环境因子差异分析

3种生境的环境因子存在一定的差异(见表1)。3个样地中相对光照度差异极显著(P＜0.01)，温度和相对湿度3生境无显著差异。其中，林内(生境Ⅰ)相对湿度最高，相对光照度较低;林缘(生境Ⅲ)则相反;林隙(生境Ⅱ)各项生境特征均处于3种生境的中间水平。

表1 密蒙花不同生境主要环境因子概况

2.4 蒙花苷、木犀草素和芹菜素的提取与测定

参照许龙等[18－19]的方法对密蒙花中3种黄酮类化合物进行提取和测定，略做修改，确定最好的流动相比例。在240～370 μm内测定吸收值，分别选择对照品蒙花苷、木犀草素和芹菜素均有的相对较大吸收波长为样品的检测波长。具体提取和测定方法:用甲醇分析纯为提取剂，分别称取0.5 g密蒙花各部位供试样品各3份，加95%甲醇25 mL，70℃水浴回流浸提2次，每次1 h，趁热过滤并用甲醇提取残渣合并洗涤液，冷却后用甲醇定容到50 mL，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，得到供试样品。色谱条件:色谱柱为 Agilent C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为 V(甲醇) ∶V(0.2%磷酸水)=56 ∶44;流速为0.8 μL·min－1;检测波长为350 nm;注温30℃。

2.5 方法学考查

2.5.1 线性关系的测定

蒙花苷、木犀草素和芹菜素标准曲线的建立:精密称取蒙花苷标准品4.1 mg、木犀草素3.2 mg、芹菜素4 mg;分别置50 mL容量瓶中，依次加50 mL甲醇溶解并稀释至刻度，制成质量浓度分别为0.082、0.064、0.08 g·L－1的对照品溶液。分别取 3 种对照品溶液，并分别进样 2、4、6、8、10 μL，测定峰面积，以峰面积积分值y对对照品的进样量x进行线性回归。

2.5.2 重复性、精密度、稳定性、加样回收率试验

重复性:取密蒙花样品，按照蒙花苷、木犀草素和芹菜素的提取制备方法同时配制6份，进样10 μL，测得相对标准偏差。精密度:分别精密量取蒙花苷、木犀草素和芹菜素对照品溶液，重复进样6次，记录峰面积，求各对照组分相对标准偏差。稳定性:取供试样品溶液存放于冰箱中(4℃)24 h，分别在 0、6、12、18、24 h 测定，记录峰面积，求各组分的相对标准偏差。加样回收率:精密吸取供试样品18份，分别置20 mL容量瓶中，分成3组，分组加入一定量的蒙花苷、木犀草素、芹菜素对照品，通过外标法分别计算加标后蒙花苷、木犀草素和芹菜素的质量分数，最后计算平均回收率和相对标准偏差。

2.6 数据处理

数据采用SPSS 19.0进行统计分析，采用方差分析及多重比较法，检验不同部位黄酮类化合物的质量分数差异，并用相关分析法对生境环境因子与次生代谢产物间的相关性进行检验。

3 结果与分析

3.1 黄酮类化合物色谱分离

在上述色谱条件下，对照品的蒙花苷、木犀草素和芹菜素的保留时间为:蒙花苷4.774 min、木犀草素 5.741 min、芹菜素 8.167 min(见图 1a—图 1c)。图1d(花蕾)为样品的保留时间，所有测定样品中蒙花苷的保留时间为(4.726±0.114)min，木犀草素的保留时间为(5.587±0.252)min，芹菜素的保留时间为(8.254±0.168)min，与对照品的保留时间误差小于0.5 min，整个分离过程需 10 min。

3.2 黄酮类化合物线性关系

3种黄酮类成分的线性方程分别为:芹菜素，R2=1;木犀草素，R2=0.9997;蒙花苷，R2=0.9997。根据线性方程可以计算出蒙花苷在质量分数为0.164～0.82 μg·g－1、木犀草素在 0.128～0.64 μg·g－1、芹菜素在 0.16～0.8 μg·g－1范围内线性关系良好，可用于定量分析。

3.3 重复性、精密度、稳定性、回收率试验结果

蒙花苷、木犀草素和芹菜素的重复性(n=6)、精密度(n=6)、稳定性(n=6)和加样回收率(n=6)的实验结果表明(见表2):样品的重现性良好、仪器进样精密度良好、样品溶液均在24 h内稳定及该实验的提取和测定方法是稳定、可信的。

图1 对照品及样品HPLC图

表2 HPLC回收率、重复性、精密度及稳定性测定结果 %

3.4 蒙花苷、木犀草素和芹菜素质量分数的相关性

由表3可以看出，3个生境中的蒙花苷质量分数与木犀草素质量分数均与木犀草素呈极显著正相关，与芹菜素呈显著正相关。而木犀草素与芹菜素质量分数除生境Ⅲ外，两者间呈显著正相关。因此，蒙花苷质量分数越高，木犀草素与芹菜素的质量分数也会相应地高些。

表3 3种黄酮类成分质量分数的相关系数

3.5 不同生境及不同部位蒙花苷、木犀草素和芹菜素质量分数对比

方差分析及多重比较分析表明，在不同生境条件下及不同开花时期，盛开花的蒙花苷质量分数显著高于花蕾(P＜0.01)，茎、叶中的质量分数差异显著(P＜0.05)，不同部位中蒙花苷质量分数从大到小顺序为花、叶、茎。由表4可知，生境Ⅱ盛开花、花蕾、茎的蒙花苷质量分数在3个生境中最高，生境Ⅰ蒙花苷质量分数均最低。茎中生境Ⅰ的蒙花苷质量分数和生境Ⅲ无显著差异;叶中生境Ⅰ的蒙花苷质量分数最低，生境Ⅱ和生境Ⅲ的蒙花苷质量分数无显著差异。

在不同生境条件下，盛开花、花蕾和茎的木犀草素质量分数生境Ⅱ与生境Ⅰ、生境Ⅲ的差异显著(P＜0.05)，而生境Ⅰ与生境Ⅲ均无显著差异(P＞0.05)，不同开花时期，盛开花的蒙花苷质量分数显著高于花蕾(P＜0.05)。可知，生境Ⅱ盛开花的木犀草素质量分数在所有的生境和部位中达到最高值，其次是生境Ⅱ花蕾中的质量分数;叶中生境Ⅰ的木犀草素质量分数最低，与生境Ⅲ相比有差异但没有达到显著水平，而与生境Ⅱ相比有显著差异(P＜0.05)，生境Ⅱ和生境Ⅲ相比木犀草质量分数有差异，但没有达到显著水平。

在不同生境条件下，花蕾、盛开花和叶的芹菜素质量分数差异极其显著(P＜0.01)，不同部位中芹菜素质量分数差异极其显著(P＜0.05)，从高到低顺序为花、叶、茎;不同开花时期，盛开花的蒙花苷质量分数显著高于花蕾(P＜0.05)。可知，茎中芹菜素质量分数生境Ⅰ最高，与生境Ⅱ生境Ⅲ有显著差异(P＜0.05)，而生境Ⅱ和生境Ⅲ无差异。其中，生境Ⅱ的各个部位的质量分数除茎外在3个生境达到最高值，其中，盛开花的芹菜素质量分数最高，其次是生境Ⅱ花蕾中的质量分数。

3.6 密蒙花3种黄酮类化合物质量分数与环境因子的相关性分析

由表5可以看出，花蕾、盛开花中的芹菜素质量分数与海拔因子呈极显著正相关，而花蕾、盛开花中蒙花苷质量分数与其呈显著正相关;花蕾、盛开花中的蒙花苷质量分数均与相对光照呈极显著正相关，花蕾、盛开花中木犀草素和芹菜素质量分数与光照呈显著正相关，叶中3种黄酮类化合物质量分数均与相对光照呈显著正相关。茎中的蒙花苷和芹菜素质量分数与相对光照呈极显著负相关，木犀草素质量分数与相对光照呈显著负相关。

表5 3种黄酮类成分质量分数与环境因子的相关系数

3种黄酮类化合物质量分数与温度和相对湿度相关性不显著。相关性结果表明，光照是影响密蒙花黄酮类化合物的主要限制因子，且随着光照的增加而增加。但是，光照对不同药用植物次生代谢的作用并不一致;研究药用植物的影响因子时，要综合考虑植物本身特定生理生化特征[20]。对于阳生植物，光照的增加能够提高其次生代谢物质的质量分数;阴生植物适当减少光照度可使次生代谢物增加;而对于中间型的半阴生植物，中等适中的光照条件才有利其维持生理代谢[20－21]。因此，光照度适中的生境Ⅱ的黄酮类化合物质量分数高于低光照生境Ⅰ的和高光照生境Ⅲ的。

4 结论与讨论

研究环境因子对药用植物次生代谢产物及药效成分的影响机制具有重要的意义，可为药用植物栽培环境的选择以及相适应的栽培技术制定提供理论依据[22－23]。环境因子(海拔、温度、水分、光照)对植物次生代谢产物的产生和积累起着重要的诱导作用甚至胁迫[24]。如:在非最佳温度下玉米向光面积累花青素防止光抑制造成伤害[25]，黄豆在低温下培养24h根部代谢水平显著增高[26]，遮阴导致高山红景天苷质量分数降低[27]，重度的水分胁迫有利于金钱草总黄酮质量分数的积累[28]。本研究中密蒙花3种黄酮类化合物质量分数均表现出中等水平强光区生境Ⅱ要显著高于弱光区生境Ⅰ和较高强光区生境Ⅲ，而生境Ⅰ最低。同时，在相关性分析中，密蒙花的花蕾、盛开花中的蒙花苷质量分数均与相对光照度呈极显著正相关，花蕾、盛开花中木犀草素和芹菜素质量分数与其呈显著正相关，叶中3种黄酮类化合物质量分数均与相对光照度呈显著正相关。这说明光照是密蒙花黄酮类成分积累的最重要限制因素。同时，根据植物对光照强度要求的不同，可分为阳生植物、阴生植物及中间类型。阳生药用植物金银花中阳坡绿原酸的质量分数高于阴坡[29]，绞股蓝在强光条件下黄酮类化合物质量分数较高[30];阴生药用植物如人参皂苷适当遮阴能增加其黄酮类化合物质量分数[31]。综合考虑相关性分析结果及密蒙花本身的生理生化特征认为，密蒙花属于半阴生植物[1，13]，低光照和高光照都不利于该植物的生长从而会影响次生代谢产物的生成。

由于植物不同生长时期器官的生理机能不同，次生代谢产物可在原处聚集或转化，这使其在植物器官中的分布情况有较大的差异[32]。本研究中，不同生境的密蒙花3种黄酮类成分均是蒙花苷质量分数最高，芹菜素质量分数次之，木犀草素质量分数最低。不同部位的比较中，3种黄酮类化合物质量分数在盛开花中最高，其次是花蕾，茎和叶的质量分数相对较低，其中茎的质量分数最低。花色素苷代谢属于类黄酮化合物代谢的分支途径，是决定花色的主要色素，除吸引昆虫帮助授粉外还具有防紫外线灼伤等作用[33－35]。杨胜远等人对密蒙花花序进行黄色素色阶分析，结果表明黄色素主要存在于花[36－37]。密蒙花以有性繁殖为主[38－39]，在密蒙花繁殖期，花为蒙花苷的主要聚集地，吸引昆虫传粉。因此，花中的黄酮类成分质量分数要显著高于其他部位，盛开花要高于花蕾。

在金城山的不同生境中，生境Ⅱ3种黄酮类化合物质量分数最高，表明中等水平光照条件有利于密蒙花次生代谢产物的合成。在引种栽培密蒙花时，应模拟野外生长条件，提供适宜的光照条件避免弱光和较高光照。密蒙花不同部位的蒙花苷、木犀草素和芹菜素质量分数均表现为盛开花要显著高于花蕾、茎和叶。因此，应在密蒙花的盛花期对要开放的花朵进行及时采收，有利于提高药材的质量。

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