中药甘遂致小鼠肝脏氧化损伤的机制研究

张秀娟，陆童，杨波，刁茜

（1.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076；2.哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076；3.哈尔滨商业大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150076；4.黑龙江中医药大学附属第一医院 药剂科，黑龙江 哈尔滨 150040）

中药甘遂致小鼠肝脏氧化损伤的机制研究

张秀娟1，2，3，陆童3，杨波1，2，3，刁茜4

（1.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076；2.哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076；3.哈尔滨商业大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150076；4.黑龙江中医药大学附属第一医院 药剂科，黑龙江 哈尔滨 150040）

目的探讨中药甘遂所致小鼠肝脏氧化损伤的作用机制。方法昆明种小鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，分别为4 g／kg组（1／8 LD50）、2 g／kg组（1／16 LD50）、1 g／kg组（1／32 LD50）及正常对照组，连续灌胃给药21 d后测定小鼠体质量及肝脏脏器系数；HE染色观察各组小鼠肝组织形态学变化；紫外分光光度法测定各组小鼠血清谷丙转氨酶（alanine amiotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）酶活性；肝组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidases，GSH-Px）水平，丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧阴离子自由基（O2-·）、羟自由基（OH·）含量的变化，流式细胞仪检测肝细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的变化。结果随着甘遂剂量增加，小鼠体质量明显下降，肝脏脏器系数显著升高（P＜0.05）；血清 ALT和 AST活性显著升高（P＜0.05）；肝组织 SOD、GSH-PX活性显著降低（P＜0.05）、MDA含量显著升高（P＜0.05）；肝组织氧自由基O2-·、OH·、ROS含量显著增高（P＜0.05）。结论甘遂通过脂质过氧化作用而引起肝损伤。

甘遂；肝功能；酶活性；氧化损伤

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材 甘遂购于哈尔滨市人民同泰大药房，批号20110926，经哈尔滨商业大学药学院张德连副教授鉴定为大戟科（Euphobiaceae）大戟属（Euphorbia）植物甘遂 Euphorbia kansuiT.N.Liou ex T.P.Wang的干燥块根。

1.1.2 动物 昆明种小鼠40只，雌雄各半，体质量（20±2）g，合格证号为黑动字第POO101006号，由黑龙江中医药大学实验动物中心繁殖提供。

1.1.3 试剂 谷丙转氨酶（alanine amiotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物（glutathione peroxidases，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、羟自由基、超氧阴离子自由基及产生超氧阴离子自由基、考马斯亮兰蛋白试剂盒，均购自南京建成生物科技有限公司；ROS试剂盒，北京碧云天公司。

1.1.4 仪器 JY3001电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；Adventurer万分之一电子天平（OHAUS公司）；QL-861型涡旋混合振荡器（江苏海门麒麟医用仪器厂）；低温高速冷冻离心机（美国Sigma）；尤尼柯 UV-210紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；FSH-2型可调高速匀浆器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；RM2126型切片机（德国LEICA公司）；C-4040ZOOM型数码相机（Olympus公司）；EPICS XL-MCL流式细胞仪（美国BECK-MAN-COULTER公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组与给药 甘遂磨粉，200目筛滤。昆明种小鼠40只，随机分成4组，雌雄各半。灌胃给药21 d，剂量分别为 1／8 LD50（1 g／kg甘遂组）、1／16 LD50（2 g／kg甘遂组）、1／32 LD50（4 g／kg甘遂组），正常对照组给予等体积蒸馏水。

1.2.2 甘遂对小鼠体质量和脏器系数的影响 脏器系数（%）＝脏器湿重（g）／体质量（g）×100%。

1.2.3 甘遂对小鼠肝脏组织形态的影响 取各组小鼠肝脏组织，HE染色后光镜下观察脏器组织结构病理改变情况。

1.2.4 甘遂对小鼠血清ALT、AST活性的影响 灌胃给药21d后各组小鼠眼球取血约2mL，3000 r／min离心10min，分离血清。505 nm处测吸光度值。根据测定管吸光度与对照管吸光度差值，查找ALT标准曲线，求得ALT、AST活力单位。

1.2.5 甘遂对小鼠肝脏SOD、GSH-Px和MDA的影响 小鼠处死后取肝脏0.3 g，用冷0.86%生理盐水漂洗，研磨成10%组织匀浆，4℃离心3000 r／min，10～15min，留上清。595 nm处，蒸馏水调零，测OD值。

1.2.6 甘遂对小鼠肝脏OH·和O2-·的影响 按照试剂盒说明书要求于595 nm测OD值。

1.2.7 小鼠肝组织中ROS含量的测定 取适量肝脏组织，PBS冲洗，胰酶37℃消化15 min，小牛血清中止，300目筛网过滤，500 r／min离心 3次，每次 2 min，收集沉淀细胞，加 1 mL 0.83%的氯化铵，1500 r／min离心10min。取900μL细胞悬液，加染色液100μL，使其终浓度为10μM，37℃孵育30 min，加1mL无血清培养液，1000 r／min离心10min，再加1m L无血清培养液洗涤，1000 r／min离心10min，加入1mL无血清培养液，过300目网，流式细胞仪检测。激发波长488 nm，发射波长525 nm。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0软件进行数据处理，正态计量数据用“±s”表示，组间比较采用用方差分析。

2 结果

2.1 甘遂对小鼠体质量和脏器系数的影响 给药21 d后，与正常对照组相比，各甘遂给药组小鼠体质量明显下降，其中4 g／kg组体质量下降最为显著；各甘遂给药组肝脏脏器系数明显升高，其中2 g／kg组和4 g／kg组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，见表1）。

表1 甘遂对小鼠肝脏脏器系数的影响Tab.1 Effects of kansui on the liver index ofmice

2.2 甘遂对小鼠肝脏组织形态的影响 HE染色结果显示：正常对照组小鼠肝细胞未见变性、坏死，无炎性细胞浸润；1 g／kg甘遂组的小鼠肝脏基本正常，偶见坏死灶；2 g／kg甘遂组肝细胞少量空泡变性，偶见坏死灶；4 g／kg甘遂组小鼠肝细胞多数呈坏死灶（见表1）。表明小鼠肝细胞内坏死灶数量随甘遂给药剂量的增加而增多。

图1 甘遂对小鼠肝脏组织形态学的影响（×400）Fig.1 Effects of kansui on the livermorphology ofmice（×400）

2.3 甘遂对小鼠血清中ALT、AST活性的影响 与正常对照组相比，各给药组血清中ALT和AST活性明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。且随着剂量的升高，活性也相应升高，呈剂量依赖性（见表2）。

表2 甘遂对小鼠血清ALT和AST活性的影响（U／L）Tab.2 Effects of kansui on the serum ALT and AST ofmice（U／L）

2.4 甘遂对小鼠肝脏SOD、GSH-Px和MDA活性的影响与正常对照组相比，各甘遂给药组SOD和GSH-Px活性均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。且活性随着给药剂量的增加而降低，呈现明显的剂量-效应关系。各甘遂给药组MDA含量均显著增加（P＜0.05，P＜0.01），且含量随着给药剂量的增加而增加（见表3）。

表3 甘遂对小鼠肝脏SOD、GSH-Px和MDA活性的影响Tab.3 Effects of kansui on the Liver SOD、GSH-Px and MDA ofmice

2.5 甘遂对小鼠肝脏OH·和O2-·的影响 与空白组相比，各给药组小鼠肝组织的OH·、O2-·均显著升高（P＜0.01），且随着甘遂剂量的增加OH·、O2-含量不断升高，呈剂量-效应关系。氧自由基的含量升高说明甘遂对小鼠肝脏有一定的氧化损伤。

表4 甘遂对小鼠肝脏OH· 和O2-·的影响Tab.4 Effects of kansui on the liver OH· and O2-·ofmice

2.6 甘遂对小鼠肝细胞ROS的影响 与正常组相比，肝细胞中ROS含量明显升高，且随着剂量的增加含量都升高，呈现剂量-效应关系（见图2）。

图2 甘遂对小鼠肝细胞ROS的影响Fig.3 Effect on the ROS ofmice-liver cell of kansui

3 讨论

肝脏是人体重要的的消化腺体，是人体最主要的代谢器官和防御器官。人体代谢产生的有毒有害物质和通过各种途径进入人体的外源性化学物质最终都在肝脏内进行转化或贮留，各种有害的物质均可引起急慢性肝损伤，从而导致肝细胞坏死和凋亡、纤维化、炎症等病理改变［8］。

实验中各给药组小鼠肝脏脏器系数较正常对照组明显升高，通过观察发现各给药组小鼠较空白组相比肝脏体积明显增大，且颜色较深。随着甘遂给药浓度的增高，肝脏颜色逐渐加深，显微镜下肝脏病理变化越严重。脏器系数增大，表示脏器可能充血、水肿、增生、肥大等变化。同时各给药组小鼠血清中的ALT、AST的活性明显高于空白组，说明给药后，小鼠的肝功能受到了一定程度的损伤。ALT主要分布于肝细胞细胞浆水溶性的部分，AST则分布于肝细胞细胞浆水溶性的部分和线粒体中，在肝脏等脏器组织受到损伤或坏死时，细胞内酶释放，流入血液，就会引起血清中相应酶活力的升高［9］，其升高的程度可间接反应肝细胞受损的程度，由于整个肝脏内转氨酶活力比血清内转氨酶总活力高成百上千倍，因此肝细胞只要有1%发生坏死，便可使血清酶活力升高1倍，在排除肝脏以外的脏器发生病变的情况下，血清内转氨酶升高，就在一定程度上反映了肝细胞损伤和坏死的程度，因此通过结果可以说明甘遂对小鼠肝功能有一定的影响。而SOD和GSH-Px的各给药组与正常组相比活性降低，差异显著，且活性随着剂量的增加而降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。MDA含量升高，细胞膜表面高浓度的氧与还原剂发生自由基的链式反应，反应终产物（主要是MDA）引起膜蛋白的共价交联与聚合，使细胞膜处于永久性缔合状态，严重影响了膜蛋白的流动性，导致膜功能的丧失，使肝细胞肿胀、坏死，实验中抗氧化酶的活性降低，而氧化产物的含量增高［10-12］，说明甘遂对小鼠肝脏具有一定的氧化损伤作用。

生物体内自由基生成反应的一大特点是它们往往以链式反应进行，正常生理状态下，氧自由基不断产生，也不断被清除，处于动态平衡状态，不会出现细胞损伤，但在病理情况下，氧自由基的产生与清除之间平衡的关系被打破，导致体内氧自由基产生过多或清除不足［13］，过度激活的氧自由基，可与细胞膜上多不饱和脂肪酸反应，发生脂质过氧化作用，也是甘遂致使小鼠肝损伤的主要机制。

综上所述，甘遂通过脂质过氧化作用引起肝脏的损伤。

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（编校：吴茜）

Study on themechanism of peroxidant damage in liver induced by Traditional Chinese M edicine Euphorbia kansui

ZHANG Xiu-juan1，2，3，LU Tong3，Yang Bo1，2，3，DIAO Qian4

（1.Institute of Bio-safety Evaluation，Center of Research and Development on Life Sciences and Environmental Sciences，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；2.Engineering Research of Natural Anticancer Drugs，Ministry of Education，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；3.School of Pharmacy，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；4.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

ObjectiveTo study themechanisms of Chinesemedicine Euphorbia kansui induced liver damage.Methods40 miceswere selected and radom ly divided into four groups according to the dose of Chinese medicine Euphorbia kansui used，there were 4 g／kg group（1／8 LD50），2 g／kg group（1／16 LD50），1 g／kg group（1／32 LD）50，and control group，which were given saline.After continuous administration for 21 d by ig，the body weight and liver coefficient ofmice in all groupswere determined，liver histological changeswere detected by HE staining.The serum enzymatic activity of alanine aminotransferase（ALT）and aspartate aminotransferase（AST），the levelsof superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSHPx），the content of malondialdehyde（MDA），superoxide anion radical（O2-·）and hydroxyl radical（OH·）were all measured by ultraviolet spectrophotometry.The changes of reactive oxygen species（ROS）contentwere detected by flow cytometry.ResultsWith the increase dose of Chinese medicine Euphorbia kansui，the body weightof ratswere decreased，and liver coefficientwere increased（P＜0.05）.The serum ALT，AST activity were significantly increased，SOD and GSH-Px activity were significantly decreased（P＜0.05），MDA content were increased significantly，radical O2-·，OH·and intracellular ROS levelswere all increased（P＜0.05）.ConclusionChinese medicine Euphorbia kansui induced liver injury though lipid peroxidation.

Chinesemedicine Euphorbia kansui；liver function；enzyme activity；oxidative damage

R285.5

A

1005－1678（2014）04－0063－04

甘遂在我国的应用历史久远，最早在《神农本草经》中被列为下品，《本草纲目》将其列入草部毒草类。甘遂为大戟科（Euphorbiaceace）大戟属（Euphorbia genus）多年生草本植物甘遂Euphorbia kansui T.N.Liou ex T.P.Wang的干燥块根［1］，甘遂具有泻水饮、破积聚、通二便等功效，常用于治疗水肿胀满、留饮、结胸、噎隔、癫痛、二便不通等症，临床上常用于治疗晚期食道癌、乳腺癌等恶性肿瘤以及慢性支气管炎、哮喘等症［2-5］。通常认为其毒性较强，临床用量也十分有限，过量则会引起腹痛、腹泻，严重时会出现剧烈呕吐、血压下降、脱水甚至呼吸衰竭等症状，炮制后可降低其毒性，缓和其峻泻作用，故临床上常使用甘遂炮制品，但近年来一些文献报道甘遂生品多应用于治疗肝硬化腹水、急性肠梗阻、重症急性胰腺炎等症［6-7］，往往在治疗效果不佳时加入甘遂生品会起到很好的疗效，但是也不应忽视其毒性，因此本文就甘遂所致小鼠肝脏氧化损伤机制进行了研究。

张秀娟，女，博士，教授，研究方向：抗肿瘤药物，E-mail：zhangmu77＠163.com。