重组人甲状旁腺素1-34对去卵巢大鼠骨质疏松的作用研究

陈波 李翠琼 朱常青 李婉媚 曹小祯

[摘要] 目的 探讨重组人甲状旁腺素1-34（hPTH1-34）对去卵巢大鼠骨质疏松的治疗作用。 方法50只7个月龄SD健康雌性大鼠，30只行双侧卵巢摘除术，20只做假手术（SHAM），12周后各处死10只证实骨质疏松造模成功。余20只双侧卵巢摘除大鼠随机分为去卵巢（OVX）安慰剂组10只和hPTH1-34治疗组10只，10只SHAM组作对照。hPTH1-34治疗组剂量为20 μg/kg，皮下注射，每周注射3次。OVX安慰剂和SHAM组皮下注射0.5 mL生理盐水，每周注射3次。治疗3个月后，测定并比较三组股骨、腰椎骨密度（BMD）、血清钙、磷、骨源性碱性磷酸酶（BALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（Trap-5b）水平。 结果 hPTH1-34治疗组股骨和腰椎BMD较OVX安慰剂组明显升高[（0.151±0.008）g/cm2比（0.135±0.013）g/cm2，（0.181±0.010）g/cm2比（0.159±0.008）g/cm2，P < 0.01]，血清钙、磷、BALP、Trap-5b水平明显高于OVX安慰剂组（P < 0.05或P < 0.01），与SHAM组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 hPTH1-34通过刺激成骨细胞的活性，抑制破骨细胞，可显著增加BMD，对去卵巢大鼠骨质疏松有效。

[关键词] 重组人甲状旁腺素1-34；骨质疏松症；骨密度；骨转换指标

[中图分类号] R580[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2014）06（b）-0017-04

Effect of human parathyroid hormone (hPTHl-34) on osteoporosis of ovariectomized rats

CHEN Bo1 LI Cuiqiong1 ZHU Changqing1 LI Wanmei1 CAO Xiaozhen2

1.Department of Endocrinology, the 12th People′s Hospital of Guangzhou City, Guangdong Province, Guangzhou 510620, China; 2.Department of Ultrasonography, the 12th People′s Hospital of Guangzhou City, Guangdong Province, Guangzhou 510620, China

[Abstract] Objective To investigate the effects of human parathyroid hormone (hPTHl-34) on the osteoporosis of ovariectomized rats. Methods 50 female 7-month-old SD rats were used for this experiment and 30 of them were ovariectomized and another 20 received sham operation. After 12 weeks of ovariectomy the osteoporosis model was confirmed by use of 10 ovariectomized and sham-operated rats. The osteoporotic rats of 20 were randomly divided into 2 treatment groups: hPTHl-34 and OVX placebo groups with 10 rats in each group, the other 10 rats were sham-operated as the control for SHAM group. Totally hPTHl-34 (20 μg/kg) were subcutaneous injected into the rats of hPTHl-34 group once every other day. The rats of the OVX placebo group and SHAM group were injected with 0.5 mL saline once every other day. The bone mineral density (BMD), serurn Ca, P, bone alkaline phosphatase (BALP), serum tartrate-resistant acid phosphatase 5b (Trap-5b) were measured after 3 months therapy. Results After 12 weeks′treatment the femoral and lumbar BMD in the hPTHl-34 group increased obviously compared with those of OVX placebo group [(0.151±0.008) g/cm2 vs (0.135±0.013) g/cm2, (0.181±0.010) g/cm2 vs (0.159±0.008) g/cm2, P < 0.01]. After treated with hPTHl-34 serum Ca, P, BALP and Trap-5b significantly increased compared with those of OVX placebo group (P < 0.05 or P < 0.01). There was no significant difference in hPTHl-34 and SHAM groups. Conclusion hPTHl-34 can stimulate osteoblast activity, inhibite bone resorption, promote bone mass effect and is effective on protection against osteoporosis.

[Key words] Human parathyroid hormone; Osteoporosis; Bone mineral density; Bone turnover markers

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种全身性骨病，以骨量减少和骨的微结构破坏为特征，使骨的脆性增加，并易发生骨折[1]，严重影响患者的生活质量。而长期卧床又可加重骨质疏松，并引发其他心肺疾患以致形成恶性循环，甚至造成死亡，给患者、家庭和社会都带来了沉重的社会及经济负担。随着老龄化社会的到来，骨质疏松症发病率逐年增长，据统计2005年美国有近250万人次因骨质疏松性骨折就诊，有43.2万患者因此入院，约18万患者需要家庭护理[2]，目前全球约有2亿患者，中国约9千万患者[3]，已经成为全球所面临的重要健康问题。通常临床上以骨密度（BMD）作为诊断和评价药物疗效的指标，由于BMD是通过测量骨质量反应骨质疏松的情况，作为疗效评价指标存在一定的滞后性，不能对患者治疗中骨代谢情况进行有效监测。2011年美国临床内分泌学会制定的绝经后妇女骨质疏松诊断及治疗指南中提出，骨转换指标可以为骨折风险预测和疗效监测提供及时有效的信息[4]。近年来，国外研究表明，小剂量间歇性皮下注射重组人甲状旁腺素1-34（hPTH1-34）对松质骨有合成作用，但对皮质骨骨量和骨质量是否有影响及有何种影响尚存在争议[5]。本研究观察了低剂量、间歇性皮下注射hPTH1-34对去卵巢大鼠股骨和腰椎BMD、血清生化指标钙、磷及骨转换指标如骨源性碱性磷酸酶（BALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（Trap-5b）的影响，初步探讨了其作用机制，为hPTH1-34治疗绝经后骨质疏松提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 造模及分组

选择7个月龄，体重（280±20）g，雌性，清洁级SD大鼠，由广东省医学实验动物中心提供，共50只。购置动物后适应1周分别进行去卵巢（OVX）和假手术（SHAM）。在无菌条件下，将5%氯胺酮注射液按100 mg/kg体重给大鼠作腹腔注射麻醉，取腰椎两旁切口进入腹腔背侧，在双侧肾脏下方脂肪组织内确认卵巢后，完整切除卵巢，术后腹腔内滴入3%过氧化氢，止血缝合，伤口酒精消毒[6]。SHAM组麻醉与手术方法均相似，保留卵巢，仅切除少许脂肪。大鼠给于标记后每5只一组分笼饲养，饲养环境温度为（25±3）℃，取12 h昼夜照明节律，相对湿度58%的环境，普通大鼠标准饲料喂养（钙含量1.33%，磷含量0.95%），自由饮水。有死亡大鼠立即造模补充，并相应延长补充大鼠的饲养时间。术后12周随机取SHAM组和OVX组各10只，放血处死时均检查双侧卵巢是否完全切除和子宫是否萎缩，取腰椎做BMD测定，确认骨质疏松模型建立后进行实验分组。共分为3个组：OVX安慰剂组（摘除大鼠双侧卵巢12周后不作任何处理，12周时与相邻组同时测BMD）、hPTH1-34治疗组（摘除大鼠双侧卵巢12周时测BMD后用hPTH1-34治疗12周），SHAM组（仅切除卵巢周围的脂肪组织约3 g，术后12周时测BMD）。

1.2药物治疗的途径和方法

hPTH1-34治疗组给予hPTH1-34（购于上海吉尔生化有限公司，批号：20130215，纯度>95%），治疗剂量为20 μg/kg，皮下注射，每周注射3次，连续12周；OVX安慰组和SHAM组皮下注射0.5 mL生理盐水，每周注射3次，连续12周。所有实验动物均服钙尔奇12 mg/（kg·d）和2.5 U维生素D3，连服12周。每周测量体重，根据体重变化调整药物剂量。各组动物于治疗后12周，用3%戊巴比妥钠麻醉，心脏采血取血标本，采用颈椎脱臼法处死去除软组织，剥离腰椎段脊柱L1～6和右侧股骨保存，用生理盐水纱布包裹维持湿度，塑料袋密封后置于-70℃低温冰箱中保存标本，以备BMD检测。

1.3 观察项目与方法

1.3.1 BMD测定应用双能X线吸收法BMD测定仪（美国GE Lunar Prodigy公司生产）进行测定全身、腰椎段脊柱L1～6和右侧股骨BMD。将标本相当于仰卧位放置于BMD仪探头下，应用附带的小动物软件对其进行扫描得出BMD值。大鼠照射范围：扫描长度为30.492 cm，扫描密度为17.912 cm，点分辨能力为0.0640 cm，精确度（CV） < 1%。结果以g/cm2表示。

1.3.2 生化指标测定三组大鼠全血5 mL离心分离血清，以美国Beckman公司的CX7全自动生化分析仪立即测定血钙、血磷及BALP含量。采用酶联免疫吸附（ELISA）法测量血清Trap-5b，试剂盒购自芬兰SBA公司，批内差异3.0%，批间差异3.4%，该试剂盒只检测新鲜释放入血的具有酶活性的Trap-5b分子，在酶标仪上405 nm波长下读取吸光度，标准品及样品均行双管测定，结果取两次平均值，单位为U/L[7]。

1.4统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠骨质疏松模型鉴定

大鼠的腰椎和股骨远端富含松质骨，股骨干富含皮质骨，OVX后骨质疏松症模型是否建立主要以子宫湿重和松质骨的BMD来判断。OVX组双侧卵巢摘除12周后，子宫湿重较SHAM组明显下降，差异有高度统计学意义（P < 0.01），股骨、腰椎BMD较SHAM组明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），表明骨质疏松模型造模成功，见表1。

2.2 hPTH1-34对骨质疏松大鼠股骨、腰椎BMD的影响

OVX安慰剂组大鼠股骨、腰椎BMD较SHAM组明显降低差异有统计学意义（P < 0.05）。hPTH1-34组治疗12周后，与OVX安慰剂组比较，治疗组的股骨、腰椎BMD明显升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01，但与SHAM组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

表2 hPTH1-34对骨质疏松大鼠股骨、腰椎BMD的影响（g/cm2，x±s）

注：与OVX安慰剂组比较，*P < 0.05，#P < 0.01；BMD：骨密度

2.3 hPTH1-34对骨质疏松大鼠生化指标的影响

OVX安慰剂组大鼠血清钙、磷、ALP、Trap-5b值较SHAM组明显低。治疗12周后，与OVX安慰剂组比较，hPTH1-34 治疗组的血清钙、磷、ALP、Trap-5b值明显升高（P < 0.05或P < 0.01），但与SHAM组相比差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

表3 重组人甲状旁腺素1-34对骨质疏松大鼠

生化指标水平的影响（x±s）

注：与OVX安慰剂组比较，*P < 0.05，#P < 0.01；BALP：骨源性碱性磷酸酶；Trap-5b：抗酒石酸酸性磷酸酶-5b

3 讨论

甲状旁腺素是甲状旁腺主细胞分泌的一种激素，含有34个氨基酸残基，是调节钙磷代谢的主要激素之一。hPTH1-34与天然甲状旁腺素氨基酸结构完全一致，具有相同的受体亲和力和生理作用，可以通过增加成骨细胞及破骨细胞数目，促进骨吸收及生长，刺激骨松质层和骨皮质层的新骨形成效应，改善骨小梁微结构，增加骨量、BMD和骨强度[8]。2002年12月美国FDA和欧洲批准了PTH应用于临床治疗绝经后和男性骨质疏松症。目前认为，PTH对骨代谢具有双向调节作用：持续升高的PTH能通过骨钙入血，维持血钙水平，最终骨量减少；治疗作用表现在有计划、小剂量、间断给予PTH可显著促进骨形成[9]。

绝经后骨质疏松症动物模型于1969年首先由Saville通过切除大鼠卵巢来建立，后被反复证实并被广泛采用，目前已成为标准化的公认的绝经后骨质疏松症病理模型。文献报道SD雌鼠去卵巢至12周左右骨质疏松症病理模型能够复制成功[10]。笔者在实验中术后12周成功制作去卵巢大鼠骨质疏松症模型，认为造模因素单一，模型确定，重复性好，实验结果可信度大。骨强度的大小除了与骨结构有关外，更主要的是与骨量相关，骨强度的60%～80%都是由骨量来决定的，骨量与骨强度成正比例关系，而BMD是全面评价骨量和诊断骨质疏松症的可靠指标，也是衡量临床骨质疏松症治疗效果的评价指标[11]。在本研究中笔者发现hPTH1-34治疗组股骨和腰椎BMD较OVX安慰剂组明显升高，且以松质骨为主的腰椎BMD升高率较皮质骨为主的股骨更加明显（P < 0.01或P < 0.05），与SHAM组无差异，提示了hPTH1-34治疗不仅能保护松质骨骨量，阻挡松质骨骨量的继续丢失，预防骨质疏松症的进一步加重，而且明显加重和恢复已丢失的骨量，使松质骨骨量达到了正常水平。

由于骨骼由生理变化反应到BMD的变化存在着滞后性，以BMD作为疗效观察指标敏感性和时效性均较差，临床中需要快速、灵敏及有效的检测指标用于原发性骨质疏松症的疗效监测。雌激素减少后，骨转化增加，骨吸收大于骨形成，导致骨量的丢失，血液中骨代谢指标能敏感地反映骨骼的变化情况，如血清骨转换标志物BALP、Trap-5b等，有关PTH治疗对骨转换等生化指标的影响报道不一[12]。BALP是组织非特异性碱性磷酸酶的一种特殊形式，由成熟阶段成骨细胞合成并分泌，与细胞外骨基质结合，是最常见的评价骨形成和骨转换的生化指标，可特异敏感性反映骨形成的活跃程度[13]。Trap-5b可反映破骨细胞的活性。本实验中通过检测去卵巢骨质疏松大鼠hPTH1-34治疗期间BALP、Trap-5b水平，分析骨转换指标在疗效监测中的价值，OVX大鼠每周3次皮下注射20 μg/kg的hPTH1-34，治疗3个月的结果显示，OVX安慰剂组大鼠血清BALP、Trap-5b水平明显低于SHAM组，证明由于雌激素水平下降，导致骨转换加快，骨形成也加快，是高转换型骨质疏松。而hPTH1-34组治疗12周后，血清中的BALP、Trap-5b水平均明显高于OVX安慰剂组，提示PTH可以降低大鼠去卵巢增加的骨转化，骨形成速率得到提高。研究还发现BALP作为疗效观察指标在监测hPTH1-34治疗原发性骨质疏松症中可能更为敏感，可以为临床提供更具时效性的数据。在促进骨合成的治疗过程中，BALP均持续升高，表明患者骨形成活跃。有研究证实OVX后大鼠破骨细胞数量持续下降而活性持续升高，破骨细胞数量与血清Trap-5b水平密切相关，在OVX大鼠，血清Trap-5b水平变化并不能真正代表破骨细胞骨吸收活性的变化，而在更大程度上代表破骨细胞数量的变化[14]。本研究结果提示在促进骨合成的治疗中，同时联合血液骨转换标志BALP、Trap-5b等的监测可以弥补单纯观察BMD导致敏感性欠缺的不足，了解用药是否规范，及时调整治疗方案，有助于更准确地判断药物的疗效及依从性，为临床治疗提供实验依据。

骨盐的主要成分是钙和磷，是骨基质的基本原料，当骨盐的流失到一定的程度，体内钙和磷就缺乏，引起血液钙和磷水平的降低。骨中钙维持着骨骼的强度。钙流失过多，骨的显微结构发生改变，则骨强度减弱。钙代谢受多种因素影响，其中之一就是雌激素的水平。雌激素作用于成骨细胞，拮抗了糖皮质激素对成骨细胞生长的抑制，阻滞了钙过多的从骨骼中游离出来[15]。本实验中，大鼠OVX后，钙含量显著降低，提示OVX能影响钙代谢，使骨骼中钙流失过多。hPTH1-34治疗12周后，血钙、磷含量显著增加，明显高于对照组，提示钙、磷代谢得到改善，考虑原因：PTH是血钙、磷的主要调节激素，文献报道PTH可增加1，25（OH）2VitD水平，后者促进肠钙、磷吸收增加和尿磷排泄减少所致[16]。

因有试验结果提示使用hPTH1-34可能会增加小鼠癌症（如骨肉瘤）的倾向，虽然在本实验未发现，但在临床应引起重视，其影响有待进一步观察与探讨[17]。总之，hPTH1-34能增强骨合成代谢，抑制骨吸收，对股骨、腰椎骨量和BMD有增高作用，是治疗绝经后骨质疏松症非常有前景的药物。

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（收稿日期：2014-03-01本文编辑：卫轲）

[基金项目] 广东省医学科学技术研究基金课题（编号WST JJ20121212430682197109140015）。