大黄酸对乳腺癌肿瘤细胞中HER-2蛋白表达的影响

陈 海 戚晓东 邱 萍

乳腺癌是临床常见恶性肿瘤之一，近年来，其发病率呈明显上升趋势，严重威胁患者的身心健康甚至是生命。原癌基因人类表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor-2,HER-2)是1种原癌基因，在多种上皮源性肿瘤具有异常扩增以及过表达现象，证实HER-2在肿瘤的发生及发展过程中具有重要意义[1]。大黄酸(Rhein)是传统中药大黄有效成分中大黄蒽醌类化合物的一种，目前已有大量研究资料表明，其具有诱导肿瘤细胞凋亡、预防肾小球硬化、抗炎、治疗糖尿病深度以及保护肝抗纤维化等作用[2]。本研究拟用大黄酸干预人乳腺癌肿瘤细胞，并观察其对HER-2蛋白表达的影响，旨在为临床应用大黄酸治疗乳腺癌的提供实验以及理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人乳腺癌SK-Br-3细胞株选自中科院上海细胞库。大黄酸选自天津药品检验所，纯度在98%以上。细胞培养基DMEM选自Gibco公司；胎牛血清均选自中科院医学生物工程研究所TBD公司；MTT、二甲基亚砜(DMSO)、明胶以及Ⅰ型胶原酶均选自Sigma公司。抗HER-2单克隆抗体选自NeoMarkers公司。DNAThennal Cycler型PCR扩增仪(Perkin Elmer公司)，DU800型核酸/蛋白分析仪(Beckman公司)，Galaxy B型CO2培养箱(RS Biotech公司)，Multiskan MK3型酶标仪(Thenno Labsystenls公司)，Pharmacia KB Multiple Ⅱ蛋白电泳系统(Pharmacia公司),LX-70型倒置荧光显微镜(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将SK-Br-3细胞株置于无菌离心管之中，加入3 ml培养基悬浮细胞，然后在室温下于1 000 r/min转速下离心分离10 min，弃去上清液，然后加入15%的胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃及含5%CO2的条件下进行培养，每3 d进行1次传代，1瓶细胞可获得传代2瓶。

1.2.2 细胞增殖活性实验 经培养的SK-Br-3细胞株按照4×103个细胞/孔将其接种于96孔细胞培养液中进行培养，24 h后待贴壁细胞生长良好以后，加入不同浓度(0、20、40和80 μmol/L)的大黄酸，继续培养0 h、24 h、48 h以及72 h后进行MTT检测。吸出上清液，然后加入20 μl 0.5 g/L的MTT，置于37 ℃下含有5%CO2培养箱中继续培养4 h，再次吸出上清液，再加入200 μl DMSO，充分振荡结晶以后应用酶标仪测定570 nm处吸光度(A)。实验设置无药对照孔以及无细胞对照孔，每组均设置3孔平行样。细胞生长抑制率=(1-药物组A/对照组A)×100%。

1.2.3 蛋白质提取以及Western blot检测 对分别应用20、40和80 μmol/L的大黄酸处理48 h以及未加药物处理的SK-Br-3细胞，采用预冷1×PBS洗涤3遍，然后加入100 ml新制细胞裂解液(50 mmol/L Tris-Hcl+150 mmol/L NaCl+1% NP-40+1 mmol/L NaF+1 mmol/L Na3VO4+10 g/L 亮抑酶肽+1% 抑蛋白酶肽+1 mmol/L 苯甲基磺酰氟)，将裂解液与细胞充分混匀，置于冰浴下处理20 min，然后在4℃转速为13 000 r/min下离心分离15 min。取上清液置于微量离心管中，采用BCA法进行蛋白含量测定，并调整各标本中的蛋白含量一致。按照测定的浓度进行蛋白上样量调整，加入1/4体积(6 μL)5×上样缓冲液，予以煮沸变性处理5 min，然后应用10% SDS-PAGE胶电泳。完成电泳后，将其转移至硝酸纤维素膜致伤，应用1%的BSA进行封闭处理1 h，应用一抗在4 ℃下孵育过夜，然后再加入相应的二抗孵育处理2 h。将化学发光剂滴至膜上，操作按照说明书进行。拍摄凝胶成像并分析条带灰度值。以条带与β-actin灰度值之比作为其蛋白相对表达量。

1.2.4 RNA提取及PCR测定 取对数生长期肿瘤细胞接种在6孔板上，分别加入不同浓度大黄酸(0、20、40和80 μmol/L)处理0、24、48、72 h，提取细胞中的总RNA，并测定吸光度。采用两步法PT-PCR进行扩增处理，检测HER-2 mRNA表达情况。PCR扩增条件：94 ℃腺癌变性处理30 s，57 ℃复性处理30 s，72 ℃延伸处理30 s，重复30次。引物片段：HER-2的上游引物为5′-ACA CTG ATA GAC ACC AAC CGC TC-3′，长度为379 bp，下游引物为5′-CGT CGT AGA AAG GTA GTAGTAGG-3′。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大黄酸对肿瘤细胞增殖的抑制作用

作用时间相同，随着大黄酸浓度的增高，细胞抑制率呈显著上升趋势；大黄酸浓度相同情况下，随着作用时间的延长，其细胞抑制率显著升高(P<0.05)，见表1。

表1 大黄酸对肿瘤细胞增殖的抑制作用

注：a为与对照组比较，P<0.05；b为与作用24 h比较，P<0.05；c为与作用48 h比较，P<0.05。

2.2 不同浓度大黄酸对乳腺癌中HER-2表达的影响

经浓度分别为0、20、40和80 μmol/L的大黄酸干预处理48 h后，检测细胞中HER-2蛋白表达水平，结果显示，对照组呈高表达，而药物组HER-2表达随着大黄酸浓度的增高而下降，见表2。

2.3 大黄酸作用不同时间对乳腺癌细胞中HER-2蛋白表达的影响

40 μmol/L大黄酸处理0 h、2 h、48 h以及72 h后检测HER-2 mRNA及蛋白表达情况。对照组HER-2呈高表达，经大黄酸处理后，HER-2的mRNA及蛋白表达水平均降低，且随着药物作用时间的不断延长，HER-2 mRNA及其蛋白表达水平呈下降趋势，见表3。

表2 不同浓度大黄酸对乳腺癌细胞中HER-2表达的影响

注：a为与对照组比较，P<0.05；b为与20 μmol/L比较，P<0.05；c为与 40 μmol/L比较，P<0.05。

表3 大黄酸作用不同时间对乳腺癌细胞中HER-2蛋白表达的影响

注：a为与对照组比较，P<0.05；b为与作用24 h比较，P<0.05；c为与作用48 h比较，P<0.05。

3 讨论

近年来，随着医疗技术的发展及各类化疗药物的问世，乳腺癌的临床疗效获得了一定程度的改善，但由于手术创伤、化疗副作用等，总体有效率仍较低。故寻找1种新的合理有效的化疗药物治疗乳腺癌，提高临床疗效、改善患者的生存质量尤为迫切。

大黄酸是中药大黄的主要活性成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒以及抗肿瘤等多种药理活性，特别是其抗肿瘤作用机制受到了广泛关注。相关研究资料证实，大黄酸对于多种恶性肿瘤细胞具有生长抑制作用，例肺癌、结肠腺癌、舌癌、卵巢癌以及鼻咽癌等[3]。此外，大黄酸联合MMC能够有效抑制肿瘤细胞中核苷的跨膜转运，从而起到抗癌的作用[4]。本研究发现，应用不同浓度的大黄酸处理乳腺癌SK-Br-3细胞，对细胞的增殖具有明显抑制作用。例如在相同作用时间下，不同浓度大黄酸对SK-Br-3细胞生长的抑制率随浓度的增加而增加，存在剂量依赖性；而在相同浓度下应用大黄酸对SK-Br-3细胞处理24 h、48 h和72 h后，SK-Br-3细胞的抑制率也呈现增加的趋势，呈现时间依赖性。认为大黄酸能够有效抑制人乳腺癌SK-Br-3的增殖，并且具有时间-剂量依赖性。

HER-2属于1种肿瘤表面抗原，临床研究表明，约有20%～80%左右的晚期乳腺癌患者具有HER-2过度表达现象，这类患者不仅病情发展迅速，且对于传统化疗药物具有明显的耐药性，极易发生化疗失败，临床预后较差，治疗后复发以及转移率较高[5]。大部分学者认为HER-2的扩增以及过表达现象与乳腺癌的发生、发展以及恶性生物学行为具有密切关系。李慧慧等[6]应用荧光原位杂交法对328例乳腺癌患者的石蜡标本进行HER-2基因扩增检测，结果显示，HER-2表达阳性率为26.2%，且HER-2表达与乳腺癌临床分级、病理类型、肿瘤直径以及腋淋巴结转移数均具有显著相关性。Duchnowska[7]认为，HER-2表达水平越高，晚期乳腺癌脑转移风险也将随之增加。本研究亦显示，在人乳腺癌肿瘤细胞SK-Br-3中，HER-2蛋白以及mRNA均呈现高表达，与相关报道的基本一致。故认为以HER-2为乳腺癌治疗靶点，通过封闭HER-2蛋白的转录及表达。

林雅军等[8]研究发现，大黄酸能够抑制乳腺癌肿瘤细胞系MCF-7、MCF-7/ADR、MDA-MB-231以及SK-Br-3细胞EGFR以及HER-2蛋白以及mRNA表达水平，且呈现剂量依赖性。本研究亦显示，应用大黄酸处理SK-Br-3细胞后，HER-2 mRNA及蛋白表达明显降低，且随着作用时间延长以及作用浓度的增加而降低。提示大黄酸能够下调SK-Br-3 mRNA及蛋白表达，从而起到抑制瘤细胞增殖的作用。细胞增殖抑制作用检测亦显示，在相同的作用时间下，大黄酸浓度为20、40和80 μmol/L时，细胞抑制率呈显著上升趋势；在相同浓度下，随着时间的延长，抑制率显著升高。认为大黄酸能够通过干预SK-Br-3细胞的HER-2信号分子表达，从而起到降低肿瘤的恶性表型，抑制癌细胞增殖的作用，可作为乳腺癌治疗的新途径[9]。Lin等[10]认为，大黄酸能够利用线粒体以及Caspase通路而诱导肿瘤细胞的凋亡。因大黄酸能够提高细胞内钙离子以及活性氧自由基的聚集，降低线粒体的膜电位，从而促进细胞凋亡诱导因子的释放，促进肿瘤细胞的凋亡。因此，抑制HER-2蛋白及mRNA表达是大黄酸诱导人乳腺癌SK-Br-3细胞凋亡的主要通路。

综上所述，HER-2高表达与乳腺癌的发生及发展密切相关，而大黄酸能够下调人乳腺癌SK-Br-3的蛋白及mRNA表达，有效抑制人乳腺癌SK-Br-3细胞的增殖，并且具有时间-剂量依赖性，可作为乳腺癌治疗的新途径。

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[2] 洪 荫,涂 健,朱 旬，等.乳腺癌组织中E-cad表达与EGFR、HER-2表达的关系〔J〕.临床与实验病理学杂志,2013,29(11):1239-1241.

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[5] 玄东春,金文彪,崔 海，等.Her-2与ALDH1在乳腺癌中表达与相关性研究〔J〕.现代仪器与医疗,2012,18(6):26-29,33.

[6] 李慧慧,马 飞,曾 瑄，等.乳腺癌HER-2的表达与临床病理特征的关系〔J〕.中华医学杂志,2011,91(2):76-80.

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[8] 林雅军,甄永苏.大黄酸对肿瘤细胞EGFR和HER-2靶点的作用及其作用机制〔J〕.癌症进展,2008,6(3):338.

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[10] Lin YJ,Zhen YZ,Zhao YF,et al.Rhein lysinate induced S-phase arrest and increased the anti-tumor activity of 5-FU in HeLa cells 〔J〕.Am J Chin Med,2011,39(4):817-825.