长效人促卵泡激素CHO细胞株的构建及其体内活性

黄晓平1,2，王晓1,2，杨春雪1,2，贾东方1,2，林俊生1,2，刁勇1,2



长效人促卵泡激素CHO细胞株的构建及其体内活性

黄晓平，王晓，杨春雪，贾东方，林俊生，刁勇

1 华侨大学分子药物研究院，福建泉州 362021 2 华侨大学生物医学学院，福建泉州 362021

黄晓平, 王晓, 杨春雪, 等. 长效人促卵泡激素CHO细胞株的构建及其体内活性. 生物工程学报, 2014, 30(6): 954−961.Huang XP, Wang X, Yang CX, et al.Expression of human long-acting FSH in CHO cell and its bioactivity in vivo. Chin J Biotech, 2014, 30(6): 954−961.

促卵泡激素 (FSH) 是具有促进卵泡与睾丸发育作用的一种垂体糖蛋白激素。因其体内半衰期较短，临床上需要连续10 d以上每天注射，病人使用非常不方便。本文旨在通过提高糖基化程度，研制一种长效FSH。通过一段含有两个N-糖基化位点的连接序列, 将人FSH α链与β链cDNA融合，并插入pcDNA3.1(+)表达载体。表达载体转染CHO-K1细胞后，通过G418筛选得到阳性单克隆细胞，并经PCR和Western blotting证实。该重组FSH为单链蛋白，分子量约为49 kDa。经无血清培养，工程细胞株培养上清液中重组FSH的表达量可达3 mg/L。单次注射该重组FSH能够促进大鼠卵巢发育与卵泡成熟，且药效与连续8次注射Folltropin-V的相近。实验结果显示，本研究已成功获得一种长效重组FSH。

促卵泡激素，CHO-K1细胞，长效，无血清培养

促卵泡激素 (FSH) 是由α和β两个亚基组成的一种糖蛋白，两个亚基通过非共价结合形成二聚体。FSH的α-亚基与其他糖蛋白激素，如绒毛膜促性腺激素(CG)、黄体素(LH) 和促甲状腺激素(TSH) 的α-亚基完全相同，而各糖蛋白激素的β-亚基则在结构上稍有差异, 从而赋予每种激素不同的生物功能。研究表明FSH的α亚基羧基端与其受体结合紧密，因此进行融合表达时都采用β亚基在后，α亚基在前提供游离的α亚羧基的连接方式。

目前市售的FSH制剂大部分是从尿液或者动物垂体中提取而来，但这些产品仍存在一定的局限性，例如半衰期短、产品纯度低、活性差，或因含有他激素和潜在的传染性病原而影响药物的疗效，已经不能满足如今市场的需求，而采用基因工程的方法可以获得纯度高、活性优的重组FSH。

中国仓鼠卵巢细胞 (CHO) 是广泛用于生产复杂蛋白质的表达系统，能对复杂糖蛋白进行很好地折叠、组装和翻译后修饰，在分子结构和生物学功能等方面更接近天然蛋白。目前已经上市的重组糖蛋白类药物基本上由CHO细胞表达系统获得。FSH β链中含有N7和 N24两个N-连接糖基化位点，而α链也含有两个糖基化位点，故本课题选择CHO表达系统。

FSH是正常妇女卵泡生长、成熟和男子精子生成所必不可少的一种糖蛋白。在当前辅助生殖周期的10–12 d中，普通FSH的制剂需要每天皮下注射1次或者2次，这种反复注射给患者带来了诸多不便。目前已有诸多方法来延长蛋白药物的半衰期，如化学修饰法、单链融合CTP、增加 N-连接糖基化等。Klein等研究表明，重组FSH在体内的半衰期为3.7 h，而增加2个N-糖基化位点的重组长效FSH在体内的半衰期为7.3 h，是普通FSH半衰期的2倍。

本课题采用含有2个N-连糖基化的连接序列，将FSH α链与β链融合成单链。α链位于融合蛋白的羧基端，提供游离的羧基，有利于重组FSH与其受体更为紧密的结合，β链位于融合蛋白的氨基端。重组质粒转染至CHO-K1细胞、G418筛选得到单克隆，进行无血清培养基培养。培养上清进行Western blotting分析和大鼠体内活性分析，为长效FSH制剂的研制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

DH5α、pcDNA3.1 (+) 由本实验室保存。CHO-K1细胞株购自ATCC细胞库。T4 DNA 连接酶、dⅢ、RⅠ、1406Ⅰ等限制性内切酶购自大连宝生物公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自碧云天公司。胎牛血清 (FBS) 购自Hyclone公司。F-12K营养混合培养基购自Thermo scientific公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。G418购自Amersco公司。Folltropin-V (Belleville, Canada)，兔抗人FSH一抗，山羊抗兔二抗均购自Abcam公司。ELISA购自Abnova公司。

1.2 方法

1.2.1 表达载体pcDNA3.1(+)-FSH的构建

按照文献[22]中的方法，使用N-连接糖基化的连接序列(氨基酸序列GSGSNATGSG SNATSGSTS)，融合人FSH α链与β链。全基因序列由南京金斯瑞公司合成，目的基因经d Ⅲ与RⅠ酶切、回收，目的基因克隆至pcDNA3.1(+)载体的d Ⅲ/RⅠ位点之间，转化至DH5α中，挑取单克隆进行PCR鉴定与质粒酶切鉴定。

1.2.2 CHO-K1细胞的转染

CHO-K1细胞用含10% FBS的F-12K营养混合培养基培养，培养温度为37 ℃，CO浓度为5%。待细胞汇合度至85%时，胰蛋白酶消化细胞，制备成悬液，接种至24孔板中。待细胞汇合度至80%时进行转染，2 μL Lipofectamine 2000与0.8 μg经过1406Ⅰ线性化的pcDNA3.1(+)-FSH质粒混合后，均匀加至含10% FBS的F-12K营养混合培养液中，培养6 h后换液。转染24 h，胰蛋白酶消化制备细胞悬液，按照1∶10比例进行继续培养，加入终浓度为800 μg/mL G418进行筛选，每3 d换一次液，直至多克隆细胞形成。

1.2.3 稳定表达FSH细胞系的筛选与鉴定

将多克隆细胞制备成细胞悬液，倍比稀释的方法筛选单克隆细胞，取单克隆细胞培养上清进行ELISA检测，将表达量较大的单克隆细胞进行多次单克隆筛选得到稳定表达FSH的细胞系，并命名为CHO-FSH。培养上清进行SDS-PAGE分离，转印至PVDF上，5% 脱脂奶粉室温封闭2 h，兔抗人FSH一抗室温孵育2 h，PBST (PBS+0.1%Twen-20) 漂洗3 次，羊抗兔二抗室温孵育2 h，漂洗3次，ECL显色成像。

分别以筛选得到的4株单克隆细胞系基因组和CHO-K1细胞的基因组为模板，以Forward (5′-TTAAGCTTATGAAGACACTCC AGTTTTTCTTCC-3′) 和Reverse (5′-TTGAATTC TTAAGATTTGTGATAATAACAAGTA-3′)为引物，进行PCR扩增。PCR条件为：95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，扩增30个循环。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定FSH基因是否已整合至CHO-K1细胞基因组中。

1.2.4 重组FSH体内活性分析

大鼠卵巢、子宫增重是测定促卵泡激素生物学活性最经典、最可靠的方法。子宫内含有大量的雌激素受体 (ERS)，雌激素通过与该受体结合，诱发细胞内反应，进而表现为子宫组织增生。选取20–23日龄SD雌性大鼠，随机分成重组FSH高剂量组 (62.5 μg/kg)、中剂量组 (12.5 μg/kg)、低剂量组 (2.5 μg/kg)、Folltropin-V 0.5 g/kg 8次注射组 (每天2次，连续注射4 d)、Folltropin-V 0.5 g/kg组 (单次注射) 和生理盐水阴性对照组。腹腔皮下注射重组FSH、阳性药物 (Folltropin-V) 或生理盐水。给药4 d后，处死大鼠，剥离出卵巢与子宫称重。多聚甲醛固定卵巢，切片、HE染色、镜检分析，实验结果进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 表达载体pcDNA3.1(+)-FSH的构建

转化后提取质粒进行酶切鉴定，结果双酶切所得的片段大小与设计的相符，约750 bp (图1)，测序结果与设计的基因序列比对结果一致，证实重组质粒构建成功。

2.2 稳定表达FSH细胞系的PCR鉴定

以筛选得到的4株单克隆细胞系和CHO-K1细胞基因组DNA为模板，利用FSH特异引物进行PCR反应，结果以4株单克隆细胞系基因组为模板的PCR产物，得到约750 bp目的片段 (图2)，与设计的FSH基因大小相符，而以CHO-K1细胞基因组为模板的PCR产物，没有检测到FSH特异性的750 bp条带，证明FSH基因已整合到CHO-K1 细胞基因组中。

图1 重组表达质粒pcDNA3.1-FSH的PCR和酶切鉴定

图2 PCR法鉴定CHO-FSH阳性细胞株

2.3 培养上清液的Western blotting分析

培养上清的Western blotting结果显示，在 49 kDa 左右有明显的印记 (图3)。证实筛选得到的细胞系能表达FSH，进一步用ELISA进行定量分析，结果显示培养上清液中重组FSH表达量为3 mg/L。

2.4 重组FSH对大鼠卵巢的影响

大鼠卵巢重量分析 (图4)，结果显示注射重组FSH组，卵巢重量与药物剂量之间呈现剂量依赖关系。重组FSH 62.5 μg/kg 组与阴性对照组相比具有显著性差异 (<0.01)；重组FSH 62.5 μg/kg组与连续8次注射Folltropin-V 0.5 g/kg组相比没有显著性差异 (>0.05)；连续8次注射Folltropin-V 0.5 g/kg组与阴性对照组相比具有显著性差异 (<0.01)；而单次注射Folltropin-V 0.5 g/kg组与阴性对照组相比没有显著性差异 (>0.05)。重组FSH 62.5 μg/kg、 12.5 μg/kg 组和连续8次注射Folltropin-V 0.5 g/kg组，大卵泡的数目(直径>275 μm) 与阴性对照组相比具有显著性的差异 (<0.05)；重组FSH 62.5 μg/kg组与连续8次注射Folltropin-V 0.5 g/kg 组相比没有显著性差异 (>0.05);而单次注射Folltropin-V 0.5g/kg组和重组FSH 2.5 μg/kg组，与阴性对照组相比，没有显著性的差异 (>0.05) (图5)。结果表明在卵巢、子宫增重和促进卵泡成熟的药效上，我们得到的重组长效FSH单次注射的药效与连续8次注射阳性药物Folltropin-V的药效相近。

2.5 长效FSH对大鼠子宫的影响

大鼠注射重组FSH和Folltropin-V结果显示：重组FSH 62.5 μg /kg组子宫增重非常明显，与正常组相比具有显著性差异 (<0.01)；重组FSH 12.5 μg/kg 组与阴性对照组相比具有显著性差异 (<0.05)，连续8次注射Folltropin-V 0.5 g/kg组与阴性对照组相比具有显著性差异 (<0.05)；而单次注射Folltropin-V 0.5 g/kg 组与阴性对照组相比没有显著性差异 (>0.05) (图6)。

图3 重组FSH Western blotting鉴定

图4 重组FSH、Folltropin-V对大鼠卵巢增重的影响

图5 重组FSH、Folltropin-V对大鼠卵泡成熟的影响

图6 重组FSH、Folltropin-V对大鼠子宫增重的影响

3 讨论

随着生物技术的飞速发展, 蛋白质药物已经在临床治疗中发挥重要的作用，然而大多数蛋白质药物在体内的生物半衰期普遍较短, 一方面是蛋白药物被体内大量存在的蛋白酶所分解, 另一方面是分子质量小的蛋白分子容易被肾小球滤过而经肾脏排泄清除。为了维持疗效，往往需要频繁用药, 长期的反复注射不仅增加了患者的痛苦, 而且易引发一系列副反应。因此迫切需要延长蛋白药物的半衰期来避免反复注射带来的诸多不便，目前第一个长效FSH制剂corifollitropin α已经上市。

本文使用含N-糖基化位点的连接序列，将FSHα与β亚基融合成单链，表达的长效FSH为单亚基结构，而不是二亚基结构，融合FSH蛋白α羧基端是处于游离状态，能与其受体结合，且β亚基位于融合蛋白的N端，而并没有影响FSH的生物活性。重组长效FSH蛋白能够促进大鼠卵巢的增重、卵泡的成熟和子宫的增重。单次注射62.5 μg/kg 重组FSH与连续8次注射0.5 g/kg Folltropin-V在卵巢、子宫增重和促进卵泡成熟的药效相当。以上的结果表明我们得到的重组FSH蛋白能延长在体内的半衰期。

本研究获得的工程细胞株经过无血清培养基驯化，悬浮生长，有利于培养规模的扩大。摇瓶中表达量达3 mg/L，比文献中报道的表达量要高。此稳定表达长效FSH细胞株的获得，为下一步研制开发长效FSH蛋白药物奠定了坚实的临床基础。

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(本文责编 郝丽芳)

Expression of human long-acting FSH in CHO cell and its bioactivity

Xiaoping Huang, Xiao Wang, Chunxue Yang, Dongfang Jia, Junsheng Lin, and Yong Diao

1 Institute of Molecular Medicine, Huaqiao University, Quanzhou 362021, Fujian, China 2 School of Biomedical Sciences Huaqiao University, Quanzhou 362021, Fujian, China

Follicle-stimulating hormone (FSH) is a pituitary glycoprotein hormone that is essential for the development of ovarian follicles and testicular seminiferous tubules. The relatively short half-life of FSHrequires daily injections for more than 10 days that is inconvenient and possibly contribute to the stress perceived by the patients. The goal of the present study was to increase FSH glycosylation, in order to develop a long-acting recombinant FSH. The cDNA of native α and β subunit of human FSH was linked by a sequence with two N-linked glycosylation sites, and the resulted DNA was inserted into pcDNA3.1 vector to generate a recombinant vector of pcDNA3.1-FSH. The pcDNA3.1-FSH was linearized and transfected into CHO-K1, positive transformants were selected by G418 and confirmed by PCR and Western blotting. A single chain recombinant FSH was expressed, with molecular weight of about 49 kDa. The recombinant FSH expression level in CHO-K1 cell strain in serum-free culture was 3 mg/L. Single injection of this recombinant FSH could induce folliculogenesis and ovulation in rats, the efficacy was similar with the commercially available FSH preparation (Folltropin-V) administrated 8 times consecutively. The results suggested a long-acting FSH was produced successfully.

follicle-stimulating hormone, Chinese hamster ovary cells, long acting, serum-free culture

September 12, 2013; Accepted:November 15, 2013

National Natural Science Foundation of China (No. 81271691), Program for International S&T Cooperation Projects of China (No. 2011DFG33320), Key Science & Technology Project of the Fujian Province, China (No. 2013N5007), Project of Huaqiao University (No. 11HZR19).

Yong Diao. Tel/Fax: +86-595-22692516; E-mail: diaoyong@hqu.edu.cn

国家自然科学基金 (No. 81271691)，国际科技合作项目 (No. 2011DFG33320)，福建省科技重大项目 (No. 2013N5007)，华侨大学校级基金 (No. 11HZR19) 资助。

网络出版时间：2013-12-17

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20131217.1059.002.html