微生物传感器的发展和应用

付 强 林初文 程立坤 陈 群

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.北京尚洋东方环境科技股份有限公司，中国 北京 100081)

微生物传感器是使用微生物活细胞或细胞碎片作为敏感元件与电化学换能器来制备的生物传感器。由于微生物传感器的核心部分是具有生物活性的微生物细胞，与基于酶的生物传感器相比，微生物传感器不需要昂贵的纯化过程，微生物在其数量、大小、繁殖、遗传改造等方面均具有独特的优势，因此可以满足环境监测中快速简单、原位、低成本的要求。

1 微生物传感器的发展简介

自1975年Devis 制成了第一支微生物传感器以来，微生物传感器研制的关键技术在于微生物的固定，传统的生物材料固定方法包括物理吸附、共价键合、交联到一定的载体基质上或包埋于有机聚合物的基质中，然而这些方法都存在稳定期短和固定时引起微生物的损伤等缺陷，从而限制了微生物传感器的发展。纳米技术的出现提供另一种更好的固定方法，纳米材料特有的光、电、磁、催化等性能，引起了凝聚态物理界、化学界及材料科学界的科学工作者的极大关注，这些进步推动了微生物传感器的发展，现将微生物传感器近年来应用情况概述如下。

2 应用

2.1 环境监测

生化需氧量，简称BOD，是水体中微生物分解有机物的过程中消耗水中溶解氧的量，以mg/L 表示。BOD 的测定对控制水体污染具有更重要的意义，传统测定BOD 的方法需要5 天，用传感器测定只需十几至几十分钟，胡磊等[1]采用接枝二茂铁为介体的微生物传感器测量污水的BOD。结果表明，传感器的线性范围为2～300mg/L，能连续工作35 天，通过对实际水样的测试表明，测得的BOD 与BOD5，具有良好的相关性。近年来，人们利用从污水和活性淤泥中富集的电化学活性微生物，构建了多种有介体或无介体微生物燃料电池（MFC）生物传感器，同时发现MFC 电流（电压）或电子库仑量与电子供体的含量之间存在一定对应关系，据此，科研人员研制出用于废水BOD[2]以及有毒物质[3]检测的MFC 生物传感器。

重金属污染广泛存在于环境中，它能通过生物富集作用对动植物及人类产生危害。利用分析化学方法检测重金属离子对其生物危害缺乏直接检定，生物传感器检测重金属离子吸引了越来越多的研究兴趣。发光微生物传感器是目前生物毒性测试中研究最多的微生物传感器之一。最常用的生物发光系统是用于水体毒性实验的Microtox 法评价。我国早在1995年就颁布了水质急性毒性的测定发光细菌法行业标准。但这些方法需要预先配制培养基、复苏菌种等复杂过程，李书钺[4]以明亮发光杆菌作为指示生物，研制的传感器将可同时分析Pb2+、Cr6+、Cd2+、Hg2+、Cu2+对发光细菌的毒性作用，该传感器与传统实验方法具有较高的相关性。此外据报道用小球藻[5]、铜绿假单胞菌烘干后死细胞[6]制成的微生物传感器也可用于重金属检测。

甲醛含量已成为当今居室、食品、纺织品中污染监测的一项重要安全指标。汤鸿雁等[7]以枯草芽孢杆菌为固定化菌株，研制甲醛微生物传感器，经测试，与乙酰丙酮分光光度法的测定结果有很好的一致性。此外，微生物传感器可以快速、高效、灵敏、准确的检测农 药[8－9]残 留。

2.2 食品和发酵工业

发酵工艺在食品、饮料等生产过程中应用广泛，温度、溶氧、pH、培养基成分、细胞浓度、产物组成及含量等均是发酵过程的重要控制参数。快速和准确的检测技术对发酵过程控制具有重要的意义，目前葡萄糖、谷氨酸、乳酸的实时监控已得到广泛应用。葡萄糖是发酵过程最重要的碳源。在这方面基于酶反应的生物传感器研制最早且已商业化，微生物传感器的研制较晚，但更具潜力，Liang 等[10]利用可表达葡萄糖脱氢酶的转基因大肠杆菌构建一种新型微生物传感器，其对葡萄糖的线性范围为50～800umol/L，检测限为4umol/L，可抗其他糖类干扰，可再生，成本低，具有良好的稳定性。

乙醇浓度是乙醇发酵、啤酒酿造工业过程中的主要控制参数，乙醇检测在工业上具有特别重要的意义。Akyilmaz 等[11]用可产生乙醇氧化酶的热带假丝酵母（Candida tropicalis）制成的安培计型传感器可用于乙醇检测，其对乙醇浓度的响应线性范围为0.5～7.5mmol/L，响应时间为2min。Valach 等人[12]构建一个安培计型微生物传感器可在流动注射分析（FIA）仪中测量乙醇，汪玉凤等[13]利用以乙醇作为唯一碳源的嗜有机甲基杆菌（Methylobacterium organophilium）研制出基于氧电极的乙醇微生物传感器，Wen 等[14]将嗜有机甲基杆菌固定于蛋膜结合氧电极研制出乙醇检测传感器，均取得满意效果。

此外，Akyilmaz 等[15]将可产生赖氨酸氧化酶的啤酒酵母用戊二醛-明胶交联固定到溶氧膜构建可检测赖氨酸的微生物传感器，经检测该传感器对赖氨酸的线性响应范围为1.0 umol/L～10umol/L，响应时间为1min。

霉菌毒素是由霉菌或真菌产生的有毒有害物质，摄入时，霉菌毒素可能会导致急性或慢性中毒。高效准确的检测霉菌毒素的含量对于食品安全具有重要的作用。据报道，以一株携带萤火虫荧光素酶系统的转基因酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）研制的微生物传感器可检测出牛奶中玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）的纳摩尔级含量[16]。

2.3 临床诊断

传统技术对各种疾病的诊断是一个耗时、复杂的过程，这使得在紧急情况下急救护理变得困难。微生物传感器在诊断激素、DNA 损伤等方面提供了一种快速、准确和廉价的方式。

Akyilmaz 等人[17]采用戊二醛交联法将冻干的白腐真菌(Phanerochaete chrysosporiumME446) 固定在凝胶修饰的铂电极上，研制出微生物传感器用于测定肾上腺素，其检测线性范围为5～100umol/L，最低检出限为1.04umol/L。

许多环境污染物可引起生物体内DNA 的损伤。DNA 损伤是一种极其重要的毒理作用，是诱发基因突变、癌症发生和发育畸形的关键因素。与基于哺乳动物细胞的检测方法相比细菌学检测DNA 损伤的方法具有灵敏、快速、简便、高通量以及可以在线、实时检测等特点。Cheng 等[18]构建了在SOS 反应中起关键作用的recA 基因启动子调控表达EGFP 基因的质粒，将其转入大肠杆菌，开发出一种可灵敏检测DNA 氧化损伤试剂的荧光细菌传感器，可用于检测医院废弃物、工业废水、农业污染以及核工业污染等领域的环境致癌物，是一种非常有前途的检测方法。

3 展望

目前应用最广的是酶生物传感器，其灵敏度较高、专一性较强且响应时间短，不过酶提取纯化难度较大，酶的保存期限相对较短，极易失活，只有在适当的理化条件下或基于某些可溶性辅助因子基础上酶才会产生作用。而依据某些微生物细胞制作的微生物传感器没有严格的理化条件限制，具有较长的保存期限，使用成本低，但也存在一些缺点，如再生速度慢，比酶电极响应时间长，由于微生物体内酶系复杂，处于一定情况下具有较差的选择性和专一性，这将是科研人员需要努力改进的地方。微流控芯片技术(Microfluidics)，近几年成为研究热点，作为一种微型化的生化分析仪器，在生物、化学、医学等领域具有巨大潜力，而电化学生物传感器具有灵敏度高、易微型化、功耗小、成本低的特点，两种技术的融合将是微生物传感器的发展方向。比如开发一种便携式的微阵列微生物传感器，使其具备高通量、快速、选择性高和集成化的功能，可同时检测空气、水、土壤中存在的多种污染，那对于环境保护工作将是何等便利。

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