盐酸曲美他嗪对心肌缺血再灌注大鼠Fas、FasL基因表达的影响

郭丽蓉，孙常青

（厦门大学附属第一医院干部保健科，福建厦门361000）

盐酸曲美他嗪对心肌缺血再灌注大鼠Fas、FasL基因表达的影响

郭丽蓉，孙常青

（厦门大学附属第一医院干部保健科，福建厦门361000）

目的通过对心肌缺血再灌注模型大鼠应用盐酸曲美他嗪，探究其对心肌细胞Fas、FasL基因表达情况的影响。方法选取44只成年健康雄性大鼠，采取随机数表法分组，正常组11只，不予任何药物及手术治疗，模型组11只，建立心肌缺血再灌注模型，实验组及对照组各11只，在模型组基础上于缺血前5min分别注射盐酸曲美他嗪10mg、1%磷酸盐缓冲液300 UI，试验后各组通过缺口末端标记法检测心肌细胞凋亡水平，并通过PCR逆转录聚合酶链反应检测Fas、FasL基因表达水平。结果大鼠心肌区形态变化提示盐酸曲美他嗪处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤能产生一定的保护作用。免疫组化分析显示对照组心肌间质只有散在染色极浅的弱阳性反应。模型组与对照组Fas、FasL表达较明显，与实验组比较，实验组表达较低。实验组与对照组均有不同程度坏死基因表达，且实验组Fas表达（0.23±0.17）、FasL表达（0.21±0.09）、坏死面积（23.41±5.37）与对照组Fas表达（0.59±0.16）、FasL表达（0.51±0.04）、坏死面积（41.66±4.19）比较显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组与对照组心肌组织电泳结果均不同程度表达，实验组较对照组Fas／FasLmRNA的水平明显降低。结论盐酸曲美他嗪能够明显降低心肌细胞缺血后再灌注的凋亡损伤水平，并通过抑制Fas、FasL基因的表达，减缓心肌再灌注损伤，对心肌缺血疾病治疗具有指导意义，值得临床推广。

盐酸曲美他嗪；心肌缺血；再灌注；凋亡；FasL

心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury） 是由于多种复杂因素的心肌细胞缺血一定时间后，血流供应恢复，造成肌细胞再灌注时凋亡增高的一类疾病［1］。主要因缺血后再灌注，导致大量钙离子内流细胞内，造成细胞内外钙离子水平失衡，细胞内钙浓度超标200倍左右，加重心脑、肝肾等器官血管急剧收缩，加重血液供应障碍［2］。据调查统计，我国每年心肌缺血再灌注损伤患者发病率从1999年的18.23%上升至2010年的32.78%，并有逐年上升趋势［3］。随着再灌注损伤治疗治疗技术的发展，人们更加重视疾病的早期诊断及预后［4］。现代医学多采取控制血氧及扩血管等方法来保护并回复心肌细胞的缺血状态，但由于多数肌细胞损伤较重并不可逆，但临床效果并不理想［5］。研究发现，盐酸盐酸曲美他嗪能抑制细胞凋亡水平，对心肌缺血起到保护性作用，降低凋亡基因Fas、FasL的表达来减轻缺血再灌注的损伤程度，最终提高临床疗效并减低死亡率。笔者做了大量研究，通过观察心肌细胞凋亡及Fas、FasL基因表达水平，来探究盐酸盐酸曲美他嗪对心肌缺血再灌注大鼠心肌受损情况，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：选取44只4周龄健康雄性大鼠（中山大学实验动物中心提供，动物合格证号为2001A032），采取随机数表法分组，正常组11只，平均体质量（275.2±27.1）g，模型组11只，平均体质量（284.2±25.4）g，对照组11只，平均体质量（293.2±19.2）g，试验组11只，平均体质量（288.3±24.9）g。依据遵循中国科学技术委员会制定的《实验动物管理条例》进行实验操作。各组实验动物的体质量、鼠龄、饲养方式、无显著性差异。

1.1.2 试验药物及试剂：盐酸曲美他嗪（LES LABORATOIRESSERVIER有限公司，注册号：H20120477），细胞凋亡水平检测试剂（Promega公司），RT-PCR逆转录聚合酶链反应试剂（北京中杉生物公司）。Taq DNA扩增聚合酶、Buffer、dNTPs试剂（TAKARA公司），PCR引物（上海生工），DulbeccocsPBS（DPBS）、蛋白酶K（Sigma公司）；Fas免疫组化SABC染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制备与给药：选取44只成年健康雄性大鼠，通并采取随机数表法分组，正常组11只，不予任何药物及手术治疗；模型组11只，通过大鼠冠状动脉左前降支2mm处应用0号丝线结扎，造成心肌缺血，并应用心电图监测心肌缺血变化，当扎紧丝线后心电图I导联或左前胸导联融合的ST-T抬高，松解丝线后抬高的ST-T下降1／3以上为模型成功。在术后45 min松解结扎线制造再灌注损伤，实验组及对照组各11只，在模型组基础上术前5min于大鼠阴茎背静脉分别注射盐酸曲美他嗪10mg、1%磷酸盐缓冲液300 UI。

1.2.2 指标检测：各组均在试验后6 h通过缺口末端标记法检测心肌细胞凋亡水平，具体步骤如下：取大鼠心肌组织打碎并制造匀浆，加入DPBS试剂7mL，在冰浴中进行匀浆并冻融3次，在5000 r／min离心机中离心30min，取上清液，放置于离心管中以15000 r／min二次离心2 h，沉淀物加用50μL氯化钾及Tris-HCL、Nonident试剂，进行悬浮试验，100℃沸水浴10 min，最后1000 r／min离心5min，取上清液3μL放入PCR仪器中检测，同时取正常组及模型组大鼠心肌组织做对照性试验。在实验结束后，取各组大鼠左室活体灌注含肝素的生理盐水后，再灌注4%多聚甲醛以预固定心肌细胞组织，解剖并取出心脏继续固定24 h，应用常规石蜡包埋心脏标本，于心肌梗死区中部沿左室轴线每隔1mm连续切取数张5μm切片，并进行HE染色心肌细胞组织，通过显微镜观察标本凋亡水平。

心肌细胞凋亡水平分析：取各组试验结束前心肌组织，PBS冲洗组织，－20°冰冻10 min，TTC染色，1 mm切片，应用图像分析系统分析并测定坏死面积。后取各组试验后大鼠心肌细胞，行切片后，HE染色，以显微镜检测组织损伤情况。

采用PCR法检测心肌组织中的FasL及Fas的mRNA表达水平：根据Hiroo Nakajima等［17］设计的Fas／FasL特异性引物序列合成引物（由上海捷瑞生物工程技术有限公司合成），扩增片段长度、引物序列、PCR反应条件等见表1：

表1 PCR引物、扩增片段长度、引物序列、反应条件Tab.1 PCR primers，amplified fragment length，primer sequence，reaction conditions

提取总RNA并行单管RT-PCR反应，做凝胶电泳及摄影分析。用IBAS图像分析仪对PCR杂交结果进行光密度扫描，测得FasL、Fas条带与GAPDH条带的峰面积积分。

免疫组化法检测心肌Fas／Fasl蛋白表达：取上述石蜡标本相应部位的连续切片各1张，免疫组化观察心肌组织Fas蛋白的表达，具体方法如下所述：石蜡切片脱腊和水化；PBS冲洗，5 min× 2次；用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10min以灭活内源性酶，蒸馏水冲洗3次；微波热修复抗原（1∶500）：将切片浸入0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH＝6.0），微波炉里加热至沸腾后断电，间隔5～10min后，反复1～2次。冷却后PBS洗涤1～2次；滴加5%BSA封闭液，室温20 min。甩去多于液体，不洗；置湿盒4℃孵育过夜；在37℃复温45min，PBS冲洗，2 min×3次；每张切片滴加生物素化二抗（1∶200），20℃～37℃20min，PBS冲洗，2 min×3次；滴加试剂SABC，20℃～37℃20 min，PBS冲洗，5 min×4次；DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1m l蒸馏水，加A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在1～5min之间；自来水充分冲洗，终止反应；苏木素轻度复染，PBS冲洗返蓝；DAB染色切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.3 统计学方法 采用统计学软件SPSS19.0进行统计学分析，正态计量数据用“±s”表示，正态资料组间比较采用t检验；P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌区形态变化比较 正常组心肌结构完整，可见散在的炎性细胞，模型组可见心肌肌纤维结构混乱，充斥大量炎性细胞，实验组可见心肌细胞恢复较好，偶见炎症因子，结构类似于正常组织，对照组则恢复较差，肌纤维结构混乱，与模型组类似（见图1）。

图1 各组心肌组织HE染色结果（×400）Fig.1 HE staining results ofmyocardial tissue（×400）

2.2 Fas、FasL基因免疫组化结果 免疫组化分析显示对照组心肌间质只有散在染色极浅的弱阳性反应。Fas、FasL基因免疫组化结果基本一致，故本文以Fas基因免疫组化结果为例，进行探讨。模型组与对照组Fas表达较明显，与实验组比较，实验组表达较低，见图2。

图2 Fas基因免疫组化结果（×400）Fig.2 Immunohistochemistry results of Fas gene（×400）

2.3 各组Fas、FasLmRNA表达水平及PCR试验扩增结果

实验结束后，各组均有不同程度的Fas、FasL基因表达，实验组表达水平，与正常组水平相似，显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；各组坏死面积均有不同程度的减少，实验组坏死面积与正常组水平相似，显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表2 各组Fas、FasL基因表达情况比较Tab.2 Comparison of the expression of Fas，FasL gene

3 讨论

心肌细胞缺血坏死是最常见的心脏系统疾病，由于药物、创伤、精神、血流动力学改变等因素，导致心肌供血不足，局部组织缺血，当血液供应恢复，造成再灌注性损伤，加重肌细胞凋亡［6-8］。主要表现为心慌、心悸，胸中痹痛，面色苍白等症状，严重者可出现心肌梗死等危重病症［9-10］。据统计，近20年心肌缺血性疾病发病率从11.33%上升到42.12%，严重影响了人们的生活质量［11］。其中5.72%～15.63%的人群可出现心肌梗死等缺血性再灌注损伤表现［12-13］。且目前临床治疗再灌注损伤主要以恢复血氧及供血水平，及应用心脏支架、搭桥等手术来根治，但由于术后心肌再梗死情况仍会发生，严重影响预后［14-15］。目前临床上可应用心肌保护性方案，预防心肌缺血后再灌注的损伤情况，主要通过平衡肌细胞内钙水平，减轻动脉平滑肌痉挛，并可降低Fsa、FsaL等凋亡基因在体内的表达情况，从而改善再灌注损伤［16］。笔者为此做了相关研究，主要通过观察心肌细胞凋亡及Fas、FasL基因表达水平，来探究盐酸曲美他嗪对心肌缺血再灌注大鼠心肌受损情况。

研究发现，正常组心肌结构完整，可见散在的炎性细胞，模型组可见心肌肌纤维结构混乱，充斥大量炎性细胞，实验组可见心肌细胞恢复较好，偶见炎症因子，结构类似于正常组织，对照组则恢复较差，肌纤维结构混乱，与模型组类似。提示示盐酸曲美他嗪处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤能产生一定的保护作用。而免疫组化分析显示对照组心肌间质只有散在染色极浅的弱阳性反应。模型组与对照组Fas、FasL表达较明显，与实验组比较，实验组表达较低。各组Fas、FasL基因表达水平及坏死面积比较：试验后，实验组与对照组均有不同程度坏死基因表达，且实验组Fas表达（0.23±0.17）、FasL表达（0.21±0.09）、坏死面积（23.41±5.37）与对照组Fas表达（0.59±0.16）、FasL表达（0.51±0.04）、坏死面积（41.66±4.19）比较明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），心肌细胞凋亡坏死后会导致大量Fas、FasL基因mRNA表达，其是一种肿瘤坏死因子，在心肌组织凋亡坏死时产生，并诱发加重坏死程度，盐酸曲美他嗪可明显降低凋亡基因表达，改善再灌注时损伤加重状态，从而保护心肌细胞，改善临床疗效。

综上所述，盐酸曲美他嗪可明显抑制肌细胞缺血后Fas、FasL基因的表达，对肌细胞形成较好保护，并维持细胞内外钙离子浓度，降低动脉血管平滑肌细胞痉挛水平，改善心脏供血，最大程度降低再灌注损伤情况，对心肌缺血疾病治疗具有指导意义，值得临床推广。

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（编校：谭玲，王俨俨）

Effect of trimetazidine hydrochloride on Fas，FasL gene expression of myocardial ischem ia and reperfusion rats

GUO Li-rong，SUN Chang-qing

（Department of Cardre's Health Care，The First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen 361000）

ObjectiveTo investigate the effectof trimetazidine hydrochloride on Fas，FasL gene expression ofmyocardial ischemia and reperfusion rats.Methods44 healthy adultmale ratswere selected and divided into four groups according to a random number tablemethod：11 rats in the normal group treated without any drugs and surgery；11 rats in model group ofmyocardial ischemia and reperfusion；11 rats in experimental group injected with trimetazidine hydrochloride and 11 rats in control group injected with 1%phosphate buffer on the basis ofmodel group treatment5min before ischemia. Myocardial apoptosis levels were detected by nick end labeling，and Fas，FasL gene expression levels were detected by PCR reverse transcription polymerase chain reaction.ResultsMorphological changes of ratmyocardial region suggest QuMei hydrochloride trimetazidine treatment on myocardial ischemia reperfusion injury in rats can produce a protective effect.Immunohistochemical analysis showed that the control group myocardial interstitial only scattered in the extremely shallow weak positive staining reaction.The model group and the control group Fas，FasL expression significantly，compared with the experimental group，the experimental group had low expression.The experimental group and the control group had varying degrees of necrosis gene expression，and Fas expression（0.23±0.17），FasL expression（0.21±0.09），necrotic area（23.41±5.37）of the experimental group were lower than those of the control group，Fas expression（0.59±0.16），FasL expression（0.51±0.04），necrotic area（41.66±4.19），and the differences were statistically significant（P＜0.05）；after the test，myocardial tissue electrophoresis results showed a different levels of expression in the experimental group and the control group，The experimental group was significantly lower than the control group Fas／FasL level of mRNA.ConclusionTrimetazidine hydrochloride could significantly reduce the level of myocardial ischemia and reperfusion apoptosis，and slow myocardial reperfusion injury by suppressing the expression of Fas，FasL gene，which has the guiding significance for the treatment of myocardial ischemia disease.

trimetazidine hydrochloride；myocardial ischemia；reperfusion；apoptosis；FasL

R541.4

A

1005－1678（2014）09－0027－04

厦门市科技计划项目（3502Z20114002）

郭丽蓉，女，本科，副主任医师，研究方向：动脉粥样硬化性心脏病，E-mail：melodyglr＠163.com。