包裹多肽二氧化硅纳米颗粒的制备和性能研究

郭丰义，沈玉莲，吴胜本，张鹏辉

（1.滨州市人民医院药学部，山东滨州256610；2.重庆医科大学临床医学系，重庆400016）

包裹多肽二氧化硅纳米颗粒的制备和性能研究

郭丰义1，沈玉莲1，吴胜本1，张鹏辉2

（1.滨州市人民医院药学部，山东滨州256610；2.重庆医科大学临床医学系，重庆400016）

目的研究在不同钙离子存在条件下二氧化硅的性质和对蛋白包裹能力有无变化，来确定其是否有作为口服载体的性能。方法研究包裹多肽二氧化硅纳米颗粒的制备、包裹多肽二氧化硅纳米颗粒的体外释放实验、包裹不同多肽的二氧化硅纳米颗粒的表征、包裹含有不同量的氯化钙和不同结构的多肽二氧化硅纳米颗粒性能。结果以含有His标签的增强绿色荧光蛋白（enhance green fluorescent portein，EGFP；PI5.99）为模型，采用反相微乳液体系中加入适量氯化钙，钙离子既和二氧化硅纳米粒子内部的氧原子形成离子键，又和His标签形成络合作用，这样就将蛋白质固定在二氧化硅纳米粒子内部，经过多次洗涤泄露较少。酶切、加热、尿素变性等试验均显示其具有良好的稳定性。结论通过在传统的反相微乳液体系中加入适量的钙离子，就可以达到良好的包裹效果，且其在酸性条件下不易释放，而在碱性条件则相对容易释放，符合用于口服药物载体的基本要求。

纳米二氧化硅；药物口服系统；蛋白质和多肽

二氧化硅纳米颗粒作为药物载体在药物的装载和释放中有很多的优势，然而，其能否有效的载带目的药物到达目的组织尚不清楚［1］。本实验室发明了一种简单、有效包裹蛋白的方法，利用钙离子很容易和带有His标签的蛋白质结合的原理，将蛋白成功地固定在二氧化硅纳米粒子内核中。本文实验中用相似的方法包裹一些多肽和蛋白，研究在不同钙离子存在条件下二氧化硅的性质和对蛋白包裹能力有无变化，另外还研究被二氧化硅纳米颗粒包裹的蛋白和多肽在模拟体液pH环境下的释放情况，来确定其是否有作为口服载体的性能。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 试剂：正硅酸乙酯（TEOS）GR 500mL；胃蛋白酶＞99%，25 g，BSA AR 25 g，Triton X-100 GR 500 mL，均来自Sigma-Aldrich；正己醇AR 500mL，环己烷AR 500mL，氯化钙AR 500 g，磷酸一氢钠AR 500 g，磷酸二氢钠AR 500 g，磷酸AR 500mL，丙酮AR 500mL，乙醇AR 500mL，碳酸钠AR 500 g，碳酸氢钠AR 500 g，氨水GR 500mL均来自国药集团化学试剂有限公司；Peptide 1＞95%，50 mg，FITC-HHHHHH＞98%，50 mg，FITC-GDDHHHHHH＞98%，50 mg，FITC-GDDDHHHHHH＞98%，50mg，FITC-GDDYHHHHHH＞95%，50 mg，均来自上海科肽生物科技有限公司。

仪器：紫外-可见分光光度计HITACHIU-3010，Japan；荧光分光光度计HITACHI F-7000，Japan；BET仪Quadrasorb SI system，美国康塔；元素分析仪PE2400ⅡPerkin Elmer，American；透射电子显微镜（TEM）JEM 200CX JEOL，Japan；高倍透射电镜（HRTEM）JEM-2010F JEOL，Japan；X射线衍射仪（XRD）D／Max-2000日本理学公司；高速冷冻离心机HITACHI CR21GⅡ，Japan；真空干燥箱DZF-6030A一恒科学仪器有限公司；鼓风干燥箱DHG-9053A一恒科学仪器有限公司；磁力搅拌器RO15德国IKA；摇床Forma Orbital Shaker Thermo Fisher。实验用水均为Barnstead Thermolyne Nanopure超纯水系统制备的超纯水。

1.2 包裹多肽二氧化硅纳米颗粒的制备 采用反相微乳液法制备包裹不同序列的多肽的二氧化硅纳米颗粒，其具体合成方法如下：将环己烷7.5 mL、表面活性剂Triton X-100 1.8 mL和正己醇1.8mL混合均匀，加入300μL的2mg／mL含有不同浓度氯化钙的水溶液作为反应的内核材料，常温下磁力搅拌1 h，再将100μL TEOS加入到微乳液体系中，再保持磁力搅拌30min，加入60μL氨水，保持搅拌24 h。反应结束后，用20mL丙酮破乳、离心分离颗粒，再分别用适量乙醇和pH 2 PBS清洗数次。

1.3 包裹多肽二氧化硅纳米颗粒的体外释放实验 将含有不同浓度氯化钙的包裹不同多肽的二氧化硅纳米颗粒分装在n（n为4组不同pH值的实验所需时间点数值之和）等分的2mL Eppendorf管中，分别用1 mL（pH 2、pH 5、pH 7、pH 8）的磷酸盐缓冲溶液溶解，将其放在摇床上于37℃、200 r／min条件下进行释放。每隔一定时间，每组pH取出一个Eppendorf管离心，弃去固体二氧化硅纳米颗粒，保留上清液。所有时间点均取完后，将各个时间点的上清液100μL溶解在900μL的pH 7.4的PBS中，用荧光分光光度计检测上清液中的多肽的量。

1.4 包裹不同多肽的二氧化硅纳米颗粒的表征

1.4.1 透射电镜表征：将包裹各种多肽药物的二氧化硅纳米颗粒用乙醇溶解，将其悬浮液分别滴加在普通铜网上，在鼓风干燥箱中干燥5 min使样品干燥，通过透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）和高倍透射电子显微镜（high resolution transmission electron microscopy，HRTEM）观察拍照。

1.4.2 BET表征：纳米材料的表面特征通常采用2个指标来表征：比表面积和孔径分布。比表面积是指单位质量粉体的总表面积，孔径分布是指粉体表面积体积随孔尺寸的变化。对纳米材料而言，其颗粒尺寸很小，比表面积和尺寸不可能直接测量，必须借助一些特别的测量工具，氮吸附法可以借助氮分子为标尺来测量材料的表面积和表面的孔容积，从而表征纳米材料。

1.4.3 XRD表征：X-射线衍射（X-ray diffraction，XRD）是通过对材料进行X射线衍射分析其衍射图谱，获得材料的成分、材料内部原子或分子的结构等信息的研究手段。其中广角X射线衍射（wide angle X-ray diffraction，XRDX）主要是对照标准谱图分析纳米粒子的组成、粒径、结晶度等。X射线小角度散射（small angel X-rays scattering，SAXA）是发生在原光束附近从1～100 nm范围内的相干散射现象。

1.5 包裹含有不同量的氯化钙和不同结构的多肽二氧化硅纳米颗粒性能研究

1.5.1 包裹多肽二氧化硅纳米颗粒稳定性考察：将制备的FITC-GDDHHHHHH＠SNPs在40℃的真空干燥箱中干燥6 h，在干燥器中放置90 d后，用荧光分光光度计检测干燥前后荧光的变化。结果显示放置90 d后，荧光强度为新配置的77.4%，由此可知二氧化硅纳米颗粒能够有效保护荧光FITC，可间接推测出纳米二氧化硅可有效保护多肽。

1.5.2 纳米二氧化硅颗粒的载药量测定：载药量＝颗粒中药物的含量／称取的颗粒的质量×100%，由于希望精确的知道二氧化硅中多肽的含量。将制备的FITC-GDDYHHHHHH＠SNPs在40℃的真空干燥箱中干燥6 h，用元素分析测得N%为2.87%，从而计算得到多肽的含量为16.39%

1.5.3 纳米二氧化硅纳米颗粒的多肽包裹率：包裹率＝载药颗粒上的药物量／实际投药量×100%［2-5］。由于有些载体对药物的包裹率可能会随着投入药物浓度的不同而有所不同。本实验中的测量条件尽可能的会控制一致。通过药物加入前后的荧光值变化量来计算包裹率。

2 结果

2.1 电子显微镜表征 如图1所示，其中A和没有包裹任何物质的二氧化硅的形态最像，因此可知其包裹量最小；B、C、F可能由于结构相似，其TEM照片也很相似，显示良好的包裹能力，相较A来看可能是由于氨基酸 D的络合作用增强包裹能力；D分子是在A分子上接了BSA，其TEM照片显现出杂乱的状况，可能是由于BSA的分子比较大，缠绕在纳米粒子周围而不是被包埋在其粒子内的缘故；E也显示良好的包裹能力，则可能也是其分子中His和氨基酸D共同络合的作用。

图1 在0.2 M钙离子存在条件下二氧化硅纳米粒子包裹多肽的电镜图Fig.1 Electron micrographs of silica nanoparticles encapsulating polypeptide under 0.2M calcium ion

2.2 BET表征 BET测试结果表明，二氧化硅纳米颗粒样品是多孔材料，且孔径直径一般小于15 nm（见图2）。

图2 含有不同浓度钙离子制备出的二氧化硅纳米颗粒的BET表征图Fig.2 The BET phenogram of silica nanoparticles in the presence of different concentration calcium ion

2.3 XRD表征 制备出来的二氧化硅纳米颗粒都是无定型的。无钙离子存在下的二氧化硅纳米颗粒的小角X射线衍射图谱所示有2个峰a和b，其中a可能是机器自身的误差所致，而b则是孔径的衍射峰［6-7］（见图3）。

图3 无钙离子存在下的二氧化硅纳米颗粒的小角X射线衍射图谱Fig.3 Small XRD patterns of silica nanoparticles prepared in the absence of calcium ion

2.4 包裹多肽二氧化硅纳米颗粒荧光稳定性考察 为了考察二氧化硅纳米颗粒是否能有效的保护多肽的性质，将制备好的FITC-GDDHHHHHH＠SNPs（FITC-GDDHHHHHH＠SNPs经分子标记的FITC-GDDHHHHHH）经清洗、离心后，平均分成2部分：一部分在pH 7.5的磷酸盐缓冲液中测量荧光值；另一部分在40℃的真空干燥箱中干燥6 h，在干燥器中放置90 d后，在同样的缓冲溶液和测量条件下用荧光分光光度计检测其荧光值［8-10］。新制备的包裹多肽二氧化硅纳米颗粒的荧光光谱图为实线；40℃下真空干燥后，在干燥器中保存90 d后的包裹多肽二氧化碳纳米颗粒荧光光谱图为虚线。被二氧化硅纳米颗粒包裹的荧光多肽以固体形式保存几个月后，再重新分散后，荧光强度为新配置的77.4%（见图4）。

图4 纳米二氧化硅包裹FITC-GDD6His的荧光光谱图Fig.4 Fluorescence spectra of silica nanoparticles encapsulating FITC-GDD6His

2.5 包裹多肽二氧化硅纳米颗粒的载药率测定 为了准确测定包裹多肽二氧化硅纳米颗粒中多肽的含量，将一份制备好的，并且经过清洗干净的FITC-GDDYHHHHHH＠SNPs（FITCGDDHHHHHH＠SNPs经分子标记的FITC-GDDHHHHHH）以及一份没有载带任何样品的二氧化硅纳米颗粒分别在40℃的真空干燥箱中干燥6 h，一同送至上海交大测试中心。用元素分析测得FITC-GDDYHHHHHH＠SNPs的氮含量为2.87%，而SNPs则没有得到数据，这是因为当氮含量小于0.1%则无法检测，从而计算得到FITC-GDDYHHHHHH＠SNPs中FITCGDDYHHHHHH的含量为16.39%。

2.6 包裹多肽二氧化硅纳米颗粒的包封率 各种不同的多肽在含有0.2 M浓度的钙离子存在下被二氧化硅纳米粒子包埋前后的荧光光谱：实线为加入的总量，虚线为未包裹的量：A：FITC-GDDD6His；B：FITC-6His；C：FITC-6His-BSA（见图5）。

图5 0.2 M浓度的钙离子存在下各种多肽被二氧化硅纳米粒子包埋前后的荧光光谱Fig.5 The fluorescence spectra of various polypeptides before and after being encapsulated by silica nanoparticles in the presence of 0.2 M calcium ion

表1 多肽在不同浓度的钙离子条件下的包裹率Tab.1 The inclusion rate of polypeptide in the presence of different concentrations of calcium ion

2.7 不同浓度氯化钙存在下多肽的释放情况 本实验中制备包裹多肽的二氧化硅纳米颗粒方法比较简单，只需在传统的反相微乳液体系中加入适量的钙离子，就能将带负电荷的蛋白质或者多肽包裹住［11-12］。多肽被二氧化硅纳米粒子包裹后释放的情况表明，不同浓度钙离子存在下被包裹多肽的释放速率变化不大，只是体外模拟释放的缓冲液酸碱度影响释放速率。

图6 在不同浓度钙离子存在条件下包裹的FITC-GDD6His＠SNPs在磷酸盐缓冲液中的释放情况Fig.6 The release of FITC-GDD6His＠SNPs in phosphate buffer under the condition of different concentrations of calcium ion

3 讨论

本文采用经典的反相微乳液体系，在反应体系中加入微量的钙离子，通过钙离子与His或者D的络合作用，将多肽固定在合成的二氧化硅纳米颗粒中。本试验中同时研究了钙离子浓度对反相微乳体系及包裹效率的影响；经释放实验表明我们合成的材料在体外模拟体液中有稳定良好的释放情况，在酸性条件下释放很少，在碱性条件下稳定高效地释放。此种方法包裹的多肽二氧化硅纳米颗粒有用作口服药物的潜力。总之，通过在传统的反相微乳液体系中加入适量的钙离子，可以达到良好的包裹效果，且其在酸性条件下不易释放，而在碱性条件则相对容易释放，符合用于口服药物载体的基本要求。

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（编校：谭玲，王冬梅）

Study on preparation and properties of silica nanoparticles encapsulating polypeptide

GUO Feng-yi1，SHEN Yu-lian1，WU Sheng-ben1，ZHANG Peng-hui2

（1.Department of Pharmacy，Binzhou People's Hospital，Binzhou 256610，China；2.Department of Clinical Medicine，Medical University of Chongqing，Chongqing 400016，China.）

ObjectiveTo research properties of silica nanoparticles encapsulating polypeptide under different calcium ion concentration conditions and ability changes of encapsulating polypeptide，and determine whether it has properties as an oral carrier.MethodsThe preparation of silica nanoparticles encapsulating polypeptide，release experiment in vivo，characterization of silica nanoparticleswith different polypeptide，and properties of silica nanoparticles encapsulating polypeptide with different concentrations of calcium chloride and different structure were studied.ResultsWith His tagged EGFP（PI 5.99）as amodel，when calcium chloride was added into reversemicroemulsion system，calcium ion could not only form ionic bonds with oxygen atoms inside the silica nanoparticles，but also form complexation with His tags.The protein was immobilized inside the silica nanoparticles，and leaked less after repeated washing.Experimental results of enzyme cutting，heating，urea denaturation showed a good stability.Conclusion By adding proper calcium ion into the traditional reverse microemulsion system，good encapsulating effect could be achieved，and it is not easy to be released in acidic conditions，while in alkaline condition is released relatively easy，which meets the basic requirements for oral drug carrier.

silica nanoparticles；oral drug delivery system；protein and peptide

R383.1

A

1005－1678（2014）08－0092－04

国家自然科学基金（03031906）

郭丰义，男，大专，主管药师，研究方向：药学，E-mail：15854308649＠163.com。