下调67LR对U251细胞系增殖的影响和对MAPK信号通路的作用

师丽娜，臧峰，尤永平

（1.淄博市第一医院医务科，山东淄博255200；2.淄博市第一医院普外科，山东淄博255200；3.南京医科大学，江苏南京210029）

下调67LR对U251细胞系增殖的影响和对MAPK信号通路的作用

师丽娜1，臧峰2Δ，尤永平3

（1.淄博市第一医院医务科，山东淄博255200；2.淄博市第一医院普外科，山东淄博255200；3.南京医科大学，江苏南京210029）

目的针对67LR设计高效的shRNA干扰质粒研究其对胶质瘤细胞增殖的影响以及对MAPK信号通路的作用，深入探讨67LR蛋白在胶质瘤细胞中的作用。方法首先对脑胶质瘤细胞系U251进行培养与转染，再进行细胞增殖检测实验，并使用Quantitative real-time PCR测定mRNA的表达量；使用Western blot检测67LR对MAPK信号通路中蛋白的影响。结果当转染下调67LR蛋白的干扰质粒48 h后，恶性胶质瘤细胞系U251增殖能力显著减弱，与对照组细胞的增殖能力存在显著差异。qRT-PCR结果显示，下调67LR的表达，导致U251细胞中MKPs变化，并且不同类MKPs的变化情况不一致。Western blot实验结果表明在脑胶质瘤细胞U251中，下调67LR的表达，导致磷酸化ERK1／2的表达下降；67LR对PI3K-mTOR信号通路没有影响。MMP-2是67LR的一个靶基因，在U251细胞系中，MMP-2参与了由67LR介导的信号转导通路。结论在脑胶质瘤细胞系U251中，下调67LR的表达会引起MMP-2表达的下降，表明MMP-2是67LR的一个靶基因，在U251细胞系中，MMP-2参与了由67LR介导的信号转导通路。

胶质瘤；增殖；MKPs；MAPKs；67LR；ATRA

层连蛋白作为细胞外基质的重要组成部分通过与细胞表面的层连蛋白受体结合产生了多种生物学功能，其中最重要的就是影响肿瘤细胞的转移和增殖［1］。研究发现，正常细胞表面的LR主要集中在细胞的基底面，从而使细胞黏着于基膜上，而在肿瘤细胞表面的LR却散布在整个细胞表面，而且大多数没有与层连蛋白结合，导致细胞可以结合更多的层粘连蛋白［2］。大量实验证明67LR的表达水平与肿瘤细胞的浸润，转移以及生长密切相关［3］，高转移潜能的肿瘤细胞往往比低恶性程度的肿瘤表达更多的67LR与37LRP。Berno等［4］研究发现肿瘤的转移机制可能是67LR通过修饰Laminin1，来激活蛋白水解酶，引起外基质的降解和肿瘤的转移。除胶质瘤以外，其在乳腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌以及卵巢癌等多种癌症中也受到了紧密的关注［5-7］。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与标本 人恶性脑胶质瘤细胞系U251购自中国科学院生命科学研究院；胶质瘤标本及正常脑组织对照标本均取自仁济医院。

1.2 实验试剂与药品 混合纤维素酯微孔滤膜（0.22μm），细胞培养用细菌过滤器（100mm）（上海百特），6孔细胞培养板，24孔细胞培养板，96孔细胞培养板，35 mm培养皿，60 mm培养皿，15mL无菌尖头离心管，50mL无菌尖头离心管（Corning）；

青霉素，链霉素，DMEM，胎牛血清，胰蛋白酶，DMSO，poly-D-lysine，DMEM细胞培养基11995（Gibco）；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent（Roche）；多聚甲醛，TritonX-100，异丙醇，琼脂糖，氯仿（华美）；DNA Markers（生工®生物工程（上海）有限公司）；TotalRNA Extractor-Trizol（生工®生物工程（上海）有限公司）；PCR DNA Markers，T4 DNA Ligase，StuⅠ酶（TaKaRa公司）；Cell Counting Kit-8（DOJINDO公司）；ECL试剂（Millipore公司）；Western及IP细胞裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；DH5α感受态细菌（TIANGEN）；质粒小抽试剂盒（TIANGEN）；一抗：兔抗人ERK1／2，p38，JNK，磷酸化ERK1／2，磷酸化p38以及磷酸化JNK；多克隆抗体（Cell Signaling）

1.3 方法

1.3.1 脑胶质瘤细胞系U251的培养与转染［8］：将含细胞的冻存管从－80℃冰箱或液氮中取出，立即置于40℃水浴中轻轻振荡1min左右，使冻存液溶解，从水浴中拿出，喷洒70%乙醇后，将细胞转移入5mL细胞培养基中，离心收集细胞沉淀，加培养基混匀，移入培养皿中。37℃，5%CO2培养，待细胞贴壁后，更换新培养液；加入2mL新鲜培养液，用枪轻轻吹打，再加入适量培养液以易于混匀细胞；取1mL细胞悬液加入装有2mL新鲜培养基的新培养皿中，放入37℃，5%CO2培养箱中培养，约3 d左右传代1次；从培养箱中取出培养板，并吸净培养基，再将已孵育好的复合物加入到每一个待转染细胞的孔中，每孔50μL，轻轻前后摇动培养板混合。细胞在37℃，5%CO2饱和湿度下常规培养48 h，观察转染结果并拍摄荧光以及常光照片。

1.3.2 细胞增殖检测实验：在96孔板中接种细胞悬液（100μL／孔）。将培养板放在培养箱中预培养（37℃，5%CO2）；待细胞汇合度达到70%～80%时，使用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent进行转染；48 h后，取出培养板，向每孔中加入6.5μL的CCK-8溶液；将培养板放回培养箱内，孵育4 h；用酶标仪在450nm处测定吸光度［9］。

1.3.3 Quantitative real-time PCR：将总RNA溶液吸取1～2μL置于Nanodrop 2000的探头上，闭合探头，开始测定，得到260nm和280nm波长分别测吸光值（A）与A260／A280的值以及RNA溶液的浓度；使用Graph Prism 5.0软件计算mRNA的相对表达量［10］。

1.3.4 Western blot：用PBST清洗封闭后的膜4次，每次5min，尽量不要有残余物；加入一抗室温孵育2 h后，用PBST清洗3次，每次5min；加入二抗室温孵育1 h后，用PBST清洗3次，每次5min；显色：取ECL试剂盒中试剂A和试剂B各500μL，混匀后，润湿膜，使其反应1min；将膜放入压片盒中，用X感光片感光约5～60 s。经显影、停影、定影和水洗后，晾干［11］。

1.4 统计学方法 实验结果用Graph Prism 5.0软件定量分析。采用SPSS 17.0统计学软件进行实验数据分析，正态计量数据用“±s”表示，正态资料组间比较采用t检验，多样本均数采用单因素方差分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑胶质瘤与正常人脑组织中67LR表达 实验结果如图1，结果表明恶性胶质瘤切片上的染色颗粒比正常人脑组织颜色明显较深，密集程度也明显较高。

图1 正常人脑组织切片和恶性脑胶质瘤切片的67LR免疫组化染色Fig.1 67LR immunohistochemical staining of normal human brain tissue and malignant brain glioma sections

2.2 67LR干扰质粒转染U251细胞 67LR干扰质粒（pSC-67LR）、乱序对照质粒（pSC-SV）由本实验室构建。pSC-67LR、pSCSV与pEGFP-C1质粒以质粒浓度3∶1共转染U251细胞48 h后，在荧光显微镜下观察细胞内出现大量明亮的绿色荧光，其中A图为未做任何处理的空白对照；B图为共转染pSC-SV与pEGFP-C1质粒48 h后，U251细胞的常光照片；C图为B图相同视野下的荧光照片；D图为共转染pSC-67LR与pEGFP-C1质粒48 h后，U251细胞的常光照片；E图为D图相同视野下的荧光照片（如图2）。

图2 pSC-67LR质粒与pEGFP-C1质粒、pSC-SV质粒与pEGFP-C1质粒共同转染脑胶质瘤细胞系U251A：空白对照；B：共转染pSC-SV与pEGFP-C1质粒48 h后，U251细胞的常光照片；C：B图相同视野下的荧光照片；D：共转染pSC-67LR与pEGFP-C1质粒48 h后，U251细胞的常光照片；E：D图相同视野下的荧光照片Fig.2 The brain glioma cell line U251 transfected by pSC-67LR plasmid and pEGFP-C1 plasmid，pSC-SV plasmid and pEGFP-C1 plasmidA：blank control group；B：48 h after co-transfection of pSC-SV and pEGFP-C1 plasmid，U251 cell constant light photo；C：fluorescence photo under the same vision of Fig.B；D.48 h after co-transfection of pSC-67LR and pEGFP-C1 plasmid，U251 cell constant light photo；E：fluorescence photo under the same vision of Fig.D

2.3 Western blot分析转染细胞系中67LR蛋白的表达变化

结果表明，转染pSC-67LR质粒组中67LR的蛋白表达量显著低于未转染组和转染pSC-SV质粒对照组（P＜0.01）。qRT-PCR与Western blot的结果表明，pSC-67LR质粒能够有效地下调胶质瘤细胞U251中67LR的表达。如图3，A图为Western blot分析转染pSC-67LR质粒48 h后，脑胶质瘤细胞U251中67LR的蛋白表达变化，β-actin为内参，Con为空白对照组，SV为转染pSCSV质粒的对照组，si67lr为转染了pSC-67LR质粒的实验组；B图是A图的灰度统计结果。

图3 Western blot检测转染细胞系67LR的蛋白表达变化**P＜0.01，与空白对照组比Fig.3 Changes of67LR protein expression in transfected cell line by Western blot **P＜0.01，compared with control group

2.4 67LR表达下调抑制脑胶质瘤细胞系U251的增殖能力 使用CCK-8试剂盒对U251细胞的增殖能力进行检测，酶标仪检测得到OD数值，经过Prism 5.0软件标准化处理后得到结果并对细胞进行对照，实验组与对照组的细胞增殖能力存在显著差异（P＜0.001）。空白对照组的OD值为（2.12±0.13），转染pSC-SV质粒对照组OD值为（1.87±0.18），转染pSC-67LR质粒实验组OD值为（1.43±0.21）。

2.5 qRT-PCR检测67LR对MKPs的影响 分别从4类MKPs中各选取一个成员进行研究。分别是：MKP-1（选择性的去磷酸化所有MAPKs）；MKP-3（选择性地去磷酸化ERKs）；MKP-5（选择性的去磷酸化JNK和p38）；PAC1（选择性地去磷酸化ERKs和p38）［12］。转染48 h，Trizol提取脑胶质瘤细胞总RNA并反转录成cDNA，以其作为模板，用MKP-1，MKP-3，MKP-5以及PAC1的特异性引物进行PCR反应。结果表明，转染pSC-67LR质粒的U251细胞中MKP-1，MKP-3和MKP-5的mRNA表达量明显高于对照组中mRNA表达量。但是PAC-1的表达量却出现了显著的下降。如图4，A图为空白对照组细胞照片；B图为转染pSC-SV质粒的对照组细胞照片；C图为转染pSC-67LR质粒的实验组细胞照片（图中标尺均为50μm）；D图为CCK-8试剂盒检测下调67LR后U251细胞增殖能力，Con为空白对照组，SV为转染pSC-SV质粒的对照组，si67lr为转染pSC-67LR质粒的实验组（P＜0.001）。

图4 转染pSC-67LR质粒48 h后，U251细胞系的增殖情况Fig.4 48 hours after pSC-67LR gene transfection，proliferation of U251 cell line

2.6 Western blot检测67LR对MAPK信号通路中蛋白的影响 为研究下调67LR抑制细胞增殖的分子机制，检测MAPK信号通路中ERK1／2，p-ERK1／2，p38，p-p38，SAPK／JNK与p-SAPK／JNK的表达情况。转染pSC-67LR质粒48 h之后，抽提脑胶质瘤细胞总蛋白，进行Western blot实验。如图5，Con为空白对照组，SV为转染pSC-SV质粒的对照组，si67lr为转染pSC-67LR质粒的实验组。A图为Western blot分析转染67LR RNA干扰质粒48 h后，胶质瘤细胞U251中MAPKs各蛋白与磷酸化MAPKs各蛋白的表达变化。β-actin为内参；B图为A图中ERK1／2，p38与SAPK／JNK总蛋白表达情况的灰度分析；C图为A图中p-ERK1／2，p-p38与p-SAPK／JNK蛋白表达情况的灰度分析。结果表明，转染了pSC-67LR质粒的细胞中，磷酸化ERK1／2明显降低（P＜0.05），但是磷酸化p38以及磷酸化SAPK／JNK并没有显著的变化。提示在抑制胶质瘤细胞U251增殖的过程中ERK1／2发挥了重要的作用，说明MAPK信号通路参与了下调67LR后，抑制肿瘤细胞增殖的过程。

图5 Western blot分析MAPK信号通路中各蛋白的总量与磷酸化后各蛋白表达的变化Fig.5 Western blot analysis of the change of the total protein expression and each protein expression in the MAPK signaling pathway after phosphorylation

2.7 Western blot分析下调67LR对MMP-2与p-mTor的影响 为研究下调67LR对MMP-2的影响，以及67LR对肿瘤细胞的调控过程中是否涉及PI3K信号通路，使用Western blot检测了转染pSC-67LR质粒48 h后，人脑胶质瘤细胞U251中，MMP-2与p-mTor的表达情况。Western blot检测转染干扰质粒细胞系U251中MMP-2与磷酸化mTor蛋白表达变化。Con为空白对照组，SV为转染pSC-SV质粒的对照组，si67lr为转染pSC-67LR质粒的实验组，β-actin为内参。

图6 Western blot检测转染干扰质粒细胞系U251中MMP-2与磷酸化mTor蛋白表达变化Fig.6 Expression of MMP-2 and phosphorylated mTor protein in interference plasmid transfected U251 cell line by Western blot

3 讨论

MAPK信号通路中的3种主要蛋白依靠磷酸化与去磷酸化来调节自身的激活与失活，从而对细胞的生理功能进行调控。研究发现［13］，磷酸酶的催化能力是激酶的100～1000倍，这是因为磷酸酶催化不需要ATP供能，属于直接反应，但是激酶催化需要消耗ATP，因此磷酸酶对信号通路的调节可能较激酶更有效率。而可以导致其失活的磷酸酶即为MKPs（MAPK磷酸酶）。根据MKPs作用底物的不同又可以将其分为4类，在本研究中选取了4类中的代表进行分析：选择性去磷酸化ERKs的MKP-3，选择性去磷酸化JNK和p38的MKP-5，去磷酸化所有的MAPKS的MKP-l以及选择性去磷酸化ERKs和p38的PAC1。qRT-PCR结果表明，除了PAC1之外，其余3种MKPs的mRNA表达上调，说明67LR对MKPs的调控机制不同，但是对同一类MKPs的调控机制是否一致，需要进一步深入研究。MKPs家族共有11个成员，每个成员都会特异选择一种或几种蛋白进行去磷酸化作用［14］。本实验检测了MKP-1，MKP-3，MKP-5与PAC1 4种MKPs的mRNA表达变化，结果显示MKP-5与PAC1的mRNA相对表达量非常低，推测不同MKPs在细胞中的含量不同对MAPK通路中各蛋白的调控能力也不同。在本研究中，正常人脑组织切片和恶性脑胶质瘤切片的67LR免疫组化染色结果表明67LR在恶性胶质瘤组织切片的表达量高于正常人脑组织切片。同时，使用CCK-8试剂盒对U251细胞的增殖能力检测实验结果显示，对照组中活细胞数量较多，细胞的增殖能力较强，实验组细胞增殖能力的减弱。Western blot结果显示磷酸化ERK1／2的表达出现明显下降，而磷酸化p38与磷酸化SAPK／JNK的表达没有发生明显变化，说明67LR通过调控ERK1／2的激活，影响肿瘤细胞的生理功能。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种丝／苏氨酸蛋白激酶，属于细胞中另外一条经典的信号通路：PI3K信号通路，它在细胞生长、增殖、分化、细胞周期调控等多个方面起到重要作用，而mTOR抑制剂能够抑制由于该信号通路异常引起的癌基因的转化、肿瘤的生长和肿瘤血管生成。说明mTOR在肿瘤生长过程中起到非常重要的作用。基质金属蛋白酶-2（matrixmetallo proteinase-2，MMP-2）作为基质金属蛋白酶家族的一员在降解ECM中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障以及肿瘤侵袭转移中起关键性作用，从而在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视。由于67LR对肿瘤的生长、增殖同样起到重要作用［15］，本研究通过Western blot的方法检测在转染了67LR RNA干扰质粒的U251细胞中磷酸化mTOR的表达。实验结果表明，67LR表达变化并不影响磷酸化mTOR的表达，说明67LR对于肿瘤细胞的调控并不是通过mTOR信号通路进行。由于MMP-2作为基质金属蛋白酶家族的一员在降解ECM中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障以及肿瘤侵袭转移中起关键性作用。因此本研究检测了下调67LR后MMP-2的表达情况。结果显示，在脑胶质瘤细胞系U251中，下调67LR的表达会引起MMP-2表达的下降，表明MMP-2是67LR的一个靶基因，在U251细胞系中，MMP-2参与了由67LR介导的信号转导通路。

［1］Satoh K，Narumi K，Abe T.Diminution of 37-kDa laminin bindingprotein expression reduces tumour formation of murine lung cancer cells［J］.British journal of cancer，1999，80（8）：1115.

［2］Yow HK，Wong JM，Chen HS，et al.Increased mRNA expression of a laminin-binding protein in human colon carcinoma：complete sequence of a full-length cDNA encoding the protein［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1988，85（17）：6394-6398.

［3］Ménard S，Tagliabue E，Colnaghi MI，et al.The 67 kDa laminin receptor as a prognostic factor in human cancer［J］.Breast cancer research and treatment，1998，52（1-3）：137-145.

［4］Berno V，Porrini D，Castiglioni F，et al.The 67 kDa laminin receptor increases tumor aggressiveness by remodeling laminin-1［J］.Endocrinerelated cancer，2005，12（2）：393-406.

［5］Viacava P，Naccarato AG，Collecchi P，et al.The spectrum of 67-kD laminin receptor expression in breast carcinoma progression［J］.The Journal of pathology 1997，182（1）：36-44.

［6］Lee WA，Kim WH，Kim YI，et al.Overexpression of the 67 kD laminin receptor correlates with the progression of gastric carcinoma［J］. Pathology-Research and Practice，1996，192（12）：1195-1201.

［7］Waltregny D，de Leval L，Ménard S，et al.Independent prognostic value of the 67-kd laminin receptor in human prostate cancer［J］.Journal of the National Cancer Institute，1997，89（16）：1224-1227.

［8］Van den Brûle FA，Castronovo V，Ménard S，et al.Expression of the67 kD laminin receptor in human ovarian carcinomas as defined by a monoclonal antibody，MLuC5［J］.European Journal of Cancer，1996，32（9）：1598-1602.

［9］Branca M，Giorgi C，CiottiM，et al.Relationship of up-regulation of 67-kd laminin receptor to grade of cervical intraepithelial neoplasia and to high-risk HPV types and prognosis in cervical cancer［J］.Acta cytologica 2011，50（1）：6-15.

［10］段燕红，任雯雯，钱艳蓉，等.层连蛋白受体67LR在胶质瘤细胞增殖中作用的研究［J］.西北农业学报，2008，17（4）：52-57.

［11］柏燕燕，史毅，惠国桢，等.EphA2对神经胶质瘤细胞系U251的凋亡、增殖、迁移和侵袭的研究［J］.生物化学与生物物理进展，2009，36（4）：464-470.

［12］楚胜华，朱志安.SLC22A18基因对人胶质瘤U251细胞化疗药物敏感性的影响［J］.肿瘤，2012，32（2）：105-108

［13］欧阳乐平，张善义，李军亮，等.过表达TAP1上调人胶质瘤细胞株U251 HLA-I的表达［J］.中国病理生理杂志，2013，29（3）：425-429.

［14］刘晓智，姜忠敏，陈镭等.miR-7沉默EGFR／PI3K通路逆转脑胶质瘤U251细胞的恶性表型［J］.肿瘤，2011，31（11）：987-992.

［15］刘宝辉，陈谦学，李明昌等.LRIG1在胶质瘤细胞系U251细胞中的作用［J］.中华神经医学杂志，2013，12（10）：980-985.

（编校：谭玲，秦晓英）

Effect of down-regulation of 67LR on the proliferation of U251 cell line and MAPK signal pathway

SHILi-na1，ZANG Feng2Δ，YOU Yong-ping3

（1.Department of Medical Services，The First Hospital of Zibo，Zibo 255200，China；2.Department of General Surgery，The First Hospital of Zibo，Zibo 255200，China；3.Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo study the effects of efficient shRNA interference plasmid designed for67LR，its impacton glioma cell proliferation aswell as to the role of MAPK signal pathway，and discuss the role of 67LR proteins in glioma cells.MethodsU251 glioma cell line was cultivated and transfected firstly，then cell proliferation was detected，and mRNA expression wasmeasured by Quantitative real-time PCR；67LR was detected on the impact of protein in the MAPK signal pathway by Western blot.ResultsWhen 48 hours after the down-regulation of67LR protein interference plasmid transfection，malignant glioma cell line U251 proliferation ability reduced significantly，which had the significantdifferencewith controlgroup.qRT-PCR results showed that，down-regulation of 67LR expression led to the change of MKPs in U251 cells，and the changes were not same of different MKPs. Western blot results showed that in U251 glioma cells，down-regulation of 67LR expression led to the decline in the expression of the phosphorylation ERK1／2；67LR had no effect on PI3K-mTOR signal pathways.MMP-2 as a target gene，in U251 cell line，MMP-2 participated in the 67 LR mediated signal transduction pathways.Conclusion In brain glioma U251 cell line，down-regulation of67LR expression could lead to the decline in the expression of MMP-2，which shows thatMMP-2 is a target gene.In U251 cell line，MMP-2 participates in the signal transduction pathwaysmediated by 67LR.

glioma；proliferation；MKPs；MAPKs；67LR；ATRA

R739.41

A

1005－1678（2014）08－0084－04

国家自然科学基金（81072078）

师丽娜，女，主治医师，研究方向：血液病学，E-mail：qch1821460063＠163.com；臧峰，通信作者，男，研究生，主治医师，研究方向：血液病学E-mail：qch1821460064＠163.com。