人参皂苷Rg1对阿尔茨海默病大鼠海马细胞周期依赖性蛋白激酶和p-tau的影响

李彦东 李 沫 苏亚楠

(东北林业大学医院检验科，黑龙江 哈尔滨 150040)

阿尔茨海默病(AD)早期病理特征最主要的表现是细胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积所导致的老年斑(SP)的形成和神经元纤维缠结(NFTs)。双股螺旋纤维(PHF)是NFTs的主要成分，异常磷酸化的tau蛋白则是导致PHF形成的最主要因素。AD患者神经元变性时，大量的细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)5被激活因子(p35、p39、p25等)所激活，激活的CDK5大量催化tau蛋白分子中连有脯氨酸的丝氨酸或苏氨酸残基的磷酸化，从而导致tau蛋白的磷酸化，最终促进退行性病变的发生和发展。本实验观察人参皂苷Rg1对AD模型大鼠海马的CDK5和磷酸化tau(p-tau)的表达影响，并探讨其对AD模型大鼠的保护作用。

1 材料和方法

1.1实验动物和分组 健康SD大鼠60只，3月龄，体重250～300 g，购置于哈尔滨医科大学实验动物中心，常规饲养。随机分为青年组、模型组、人参皂苷Rg1小剂量组和人参皂苷Rg1大剂量组，每组15只。

1.2主要药物和试剂 D-半乳糖溶液、Aβ1～40(上海江莱生物科技有限公司)；抗体CDK5和抗磷酸化p-tau(Ser404)(北京博奥森生物技术有限公司)。人参皂苷Rg1，纯度≥98%(上海纯优生物科技有限公司)。

1.3造模与用药 D-半乳糖溶液50 mg/kg大鼠腹腔注射，连续注射6 w后施行海马区注射〔1〕，每侧注入Aβ1～40溶液1 μl。术后连续3 d腹腔注射青霉素10万U/d。造模成功后，人参皂苷RgH剂量组给予人参皂苷Rg1 20 mg·kg-1·d-1灌胃，人参皂苷Rg1大剂量组给予人参皂苷Rg1 40 mg·kg-1·d-1灌胃，青年组和模型组以等量生理盐水灌胃，灌胃体积为20 ml/kg，1次/d，连续30 d。

1.4取材与检测 造模成功的AD大鼠用药30 d后，断头取双侧海马，一侧海马制作石蜡切片，应用免疫组织化学(SABC法)检测CDK5和p-tau(Ser404)的表达情况，阳性表达为胞质内呈现棕黄色颗粒。使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计算阳性染色的平均光密度值。另一侧海马提取蛋白，利用Western印迹法检测大鼠海马CDK5和抗体p35的表达。使用Tanon GIS 4.0凝胶图像分析软件对条带的光密度值进行分析。所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.5统计学处理 使用SPSS17.0软件进行单因素方差分析LSD检验。

2 结 果

SABC染色结果和Western印迹结果均表明，海马CA3区，与青年组比较，模型组CDK5和p-tau(Ser404)蛋白阳性染色均明显增强(P<0.05)，表明模型组的CDK5激活量增加，活性增强；tau蛋白ser404位点磷酸化增多。与模型组比较，人参皂苷Rg1、小、大剂量组CDK5和p-tau(Ser404)蛋白阳性染色均明显减弱(P<0.05)，表明这两个治疗组中CDK5激活量和活性均较模型组明显降低；tau蛋白ser404位点磷酸化减弱。大剂量组与小剂量组比较，CDK5和p-tau(Ser404)蛋白阳性染色程度有所降低，但无统计学意义(P>0.05)(表1、图1和图2)。

表1 各组海马CA3区CDK5 与p-tau(Ser404)蛋白表达

A.青年组；B.模型组；C.人参皂苷Rg1小剂量组；D.人参皂苷Rg1大剂量组；下图同

图2 各组海马区CDK5与p-tau(Ser404)蛋白表达(Western印迹)

3 讨 论

tau蛋白是神经细胞中含量最高的微管相关蛋白，对促进微管的形成和维持微管稳定性有着非常重要的作用〔2〕。在正常人脑中，tau蛋白的磷酸化水平相对比较低，但在AD时，过度磷酸化的tau蛋白失去了其生物学功能，并具有神经毒性〔3〕。tau蛋白的异常过度磷酸化被认为是AD致病的关键因素。tau蛋白过度磷酸化主要受到蛋白激酶活性与磷酸酯酶活性的调控，与脯氨酸介导的蛋白激酶(PDPK)关系较为密切的CDK5对tau的磷酸化起着非常重要的作用。

CDK5在神经系统中的含量是最高的，是神经发育、神经元迁移、轴突运输及多巴胺信号通路传导等方面的重要调节因子〔4〕。CDK5单体无酶的活性，只有与其调节亚基p35或p39结合后才具有酶的活性，其中以p35的作用最为重要。在病理条件下，p35可经中性钙蛋白酶作用，水解为p25，p25要比p35稳定，从而更大地发挥激活CDK5的作用。p35仅在脑中表达，所以CDK5是主要在神经系统起作用的蛋白激酶。激活后的CDK5可催化在C端连有脯氨酸的丝氨酸或苏氨酸残基的磷酸化， Augustinack等〔5〕研究发现，AD病人的NFTs的神经元中CDK5含量较正常对照组要高，同时，tau蛋白的磷酸化程度以及p25含量都相应升高。许多tau蛋白分子中位点是脯氨酸指导的位点，主要有Ser199、Thr205、Ser396和Ser404等，因此能被CDK5有效地磷酸化。本实验结果表明CDK5过表达时，可导致tau蛋白某些位点的磷酸化；CDK5活性受到抑制后，tau蛋白的某些位点的磷酸化程度就会降低，这与文献报道〔5〕一致。陈娟等〔6〕报道，在利用基因转染技术建立过度表达CDK-5的鼠成神经瘤细胞株中，CDK5过度表达引起tau蛋白过度磷酸化，二者之间存在正相关关系。这些提示CDK5参与AD的早期NFTs形成的病理过程。

人参皂苷Rg1是人参中主要的生物活性成分，有抗氧化应激、抑制细胞凋亡、促进脑损伤修复等作用。近年来，人参皂甙Rg1对神经保护作用和治疗神经退行性疾病的受到关注〔7〕。谢玉华等〔8〕研究发现，人参皂苷Rb1具有与CDK5特异性抑制剂相似的作用，减轻Aβ25～35诱导的胎鼠海马神经元tau蛋白在Thr205、Ser396和Ser404位点的过度磷酸化程度。本实验提示人参皂甙Rg1能通过抑制CDK5的活性来减弱tau蛋白的磷酸化程度，从而抑制或减缓AD模型大鼠的病理改变。人参皂苷Rg1对AD的作用机制的尚不十分明确，随着对其治疗神经退行性疾病机制的研究不断深入，可能会成为临床治疗AD的一种新药。

4 参考文献

1Paxinos G,Watson C. The rat brain in sterrotaxic coordinated (4nd)〔M〕.Australia:Academic Press Australia,1998:80-9.

2Dixit R,Ross JL,Goldman YE,etal.Differential regulation of dynein and kinesinmotor proteins by tau〔J〕.Science,2008;319(5866):1086-9.

3Mocanu MM,Nissen A,Eckermann K,etal. The potential for p-structure in the repeat domain of tau protein determines aggregation,synaptic decay,neuronal loss and coassembly with endogenous Tau in inducible mouse models of tauopathy〔J〕. J Neurosci,2008;28(3):737-48.

4Ko J,Humbet S,Bronson RT,etal.p35 and p39 are essential for cyclin-dependent kinase 5 function during neuro development〔J〕.J Neurosci,2001;21:6758.

5Augustinack JC,Sanders JL,Tsai LH,etal. Colocalization and fluorescence resonance energy transfer between CDK5 and AT8 suggests a close association in pre-neurofibrillary tangles and neurofibrillary tangles〔J〕.J Neuropathol Exp Neurol,2002;61(6):557-64.

6陈 娟,李宏莲,王建枝,等. CDK5过度表达对tau蛋白磷酸化的影响〔J〕.中国组织化学与细胞化学杂志,2004;13(3):174-6.

7李 娜.人参皂苷Rg1治疗神经退行性疾病的研究进展〔J〕. 中国老年学杂志,2012;32(15):3345-7.

8谢玉华,陈晓春,张 静,等. 人参皂苷Rb1可能通过CDK5途径减轻Aβ25-35诱导的胎鼠海马神经元tau蛋白过度磷酸化〔J〕. 药学学报,2007; 42(8): 828-32.