碱性成纤维细胞生长因子、cAMP反应元件结合蛋白和Bcl-2在卵巢上皮性恶性肿瘤中的表达及意义

叶丽平 马静方 杨春雨 仇会会

(辽宁医学院基础医学院，辽宁 锦州 121000)

卵巢癌是人体病理类型最多最复杂的恶性肿瘤,其发生发展与肿瘤的增殖及凋亡的失控有着密切关系。研究表明，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)激活的多种信号通路与肿瘤细胞增殖、凋亡及转化等密切相关且bFGF可以显著地促进卵巢癌的增殖，侵入和血管的发生，但其具体发生机制仍不明确。前期试验表明，在卵巢癌中，bFGF可抑制无血清饥饿诱导的细胞凋亡;促进cAMP反应元件结合蛋白(CREB)及Bcl-2 mRNA及蛋白表达增加。本实验探讨CREB、bFGF和Bcl-2蛋白与卵巢恶性上皮性肿瘤发生的关系表达。

1 资料与方法

1.1病例资料和组织标本 收集2004年1月至2011年6月辽宁医学院附属第一医院妇产科卵巢癌手术切除标本120例，患者年龄31～84岁。其中卵巢恶性上皮性肿瘤82例(浆液性囊腺癌26例，黏液性囊腺癌24例，子宫内膜样囊腺癌 32例)；卵巢良性肿瘤组织20例，卵巢正常组织18例。所有患者术前均未接受放、化学或免疫治疗，且均具有完整临床资料。所有标本均经我院病理科确诊。

1.2标本的处理 组织标本均用磷酸缓冲液配置的 10%中性甲醛固定液及时固后,进行乙醇梯度脱水，二甲苯透明以及石蜡包埋，4 μm厚连续切片。

1.3免疫组织化学实验 (1)兔抗人bFGF多克隆抗体购自福建迈新工作液，兔抗人CREB多克隆抗体购自美国Abcam公司，兔抗人Bcl-2购自北京中杉工作液， SP超敏试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司 按试剂盒说明书步骤进行染色，每次试验均设阴性对照，用磷酸盐(PBS)缓冲液代替一抗作为阴性对照，以公司提供的阳性片染色作为阳性对照。(2)实验结果判断：细胞内呈棕黄色颗粒状为阳性表达，其中bFGF阳性表达位于细胞质，CREB阳性表达位于细胞核，Bcl-2阳性表达位于细胞质。评分方法：每张切片400倍显微镜下随机选取 5个视野：①阳性细胞数：每个视野记数100个细胞，计算5个视野的阳性细胞的平均百分数分为4级：阳性细胞数1%～24% 为1分；25%～49%为2分；50%～74%为3分；大于75%为4分。②染色强度：无着色0分；浅黄色1分；黄或深黄色2分；褐或棕褐色3分，上述两项相乘为分级标准：<4分定义为低表达，≥4分定义为高表达〔1〕。观察结果由两名病理科医师采取盲法判断。

1.4统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行t和χ2检验。相关性分析采用Spearman相关分析法。

2 结 果

图1 bFGF、CREB和Bcl-2在卵巢癌中的表达(DAB，×200)

2.1CREB、bFGF和Bcl-2在卵巢恶性肿瘤、卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织中表达 bFGF和Bcl-2阳性表达均定位于细胞质，CREB阳性表达位于细胞核(图1)。在82例卵巢恶性肿瘤中，bFGF、CREB和Bcl-2分别有例57、62例和57例呈高表达；在20例卵巢良性肿瘤中，bFGF、CREB和Bcl-2分别有6例、8例和5例呈高表达；在18例正常卵巢组织中，bFGF、CREB和Bcl-2分别有2例、4例和2例呈高表达。bFGF、CREB和Bcl-2在卵巢恶性肿瘤组织中的表达明显高于卵巢良性肿瘤、正常卵巢组织(P=0.000)。

2.2bFGF、CREB和Bcl-2蛋白表达与卵巢癌临床病理学参数关系 bFGF、CREB和Bcl-2表达与肿瘤分期和淋巴结转移有显著的相关性，在分期较高，有淋巴结转移者，bFGF、CREB和Bcl-2的表达明显增高，其中bFGF的表达与组织的分化程度有关，但三者的表达年龄、肿瘤的组织学类型均无显著的相关性。见表1。

表1 bFGF、CREB和Bcl-2蛋白表达与卵巢癌临床病理学参数关系(n)

2.3bFGF、CREB和Bcl-2三者表达的相关性 在卵巢恶性肿瘤组织中，bFGF与CRER(r=0.426，P=0.000)、CREB与Bcl-2(r=0.673，P=0.000)和Bcl-2与bFGF(r=0.540，P=0.000)蛋白表达呈显著正相关。

3 讨 论

卵巢癌的发生发展与肿瘤的增殖及凋亡的失控密切相关。CREB是一种真核生物细胞核内调控因子，其功能表现在生命活动的许多方面,包括调节基因的转录、生理节奏、细胞的发育与生存、成瘾性和抑郁以及学习记忆等〔2〕。bFGF可通过与其受体FGFR结合激活多种信号转导通路，活化CREB调控多种基因转录,表现出多种生理功能，MEK/ERK及PI3K/PKB 信号转导通路是由bFGF激活的经典信号通路,与肿瘤细胞增殖、凋亡及转化等密切相关〔3，4〕。前期研究表明bFGF可快速激活人卵巢癌CAOV3细胞ERK活性，诱导CREB磷酸化以及抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达，并显著抑制了无血清培养诱导的细胞凋亡，推测bFGF可能通过激活MEK/ERK1/2/CREB/bcl-2信号转导途径抑制卵巢癌CAOV3细胞凋亡〔5〕。

bFGF可以促进多种细胞的有丝分裂活动，而且可以促进血管内皮细胞的增殖。在肿瘤中，bFGF可以自分泌的方式促进有丝分裂和血管的发生〔6〕。因此bFGF的表达与多种肿瘤发生有关，如结直肠癌，卵巢癌等〔7，8〕。

近来研究发现CREB在许多恶性肿瘤发生发展中均扮演着重要的角色，如淋巴瘤，乳腺癌，黑素瘤和肝癌〔9〕。CREB高表达与细胞增殖和存活正相关,抑制CREB表达,可阻遏肿瘤细胞恶性增殖，增强化疗药物敏感性，前期研究结果也表明，RNA干扰降低CREB的表达可以降低卵巢癌细胞的增殖〔10〕，但在卵巢癌组织中CREB的表达情况研究较少。

众多免疫组化研究结果均表明，在恶性肿瘤中，CREB的表达均比良性肿瘤及正常组织明显增高，如结直肠癌非小细胞型肺癌，前列腺癌〔11，12〕，同样，在卵巢癌中CREB的表达也比卵巢正常组织明显增高〔13〕，与本研究结果一致。研究表明，在结直肠癌中，bFGF的表达与肿瘤的分期，分级，淋巴转移有关，随着分期和分级的增加，bFGF的表达增高〔7〕。在卵巢癌中，有研究表明，随着FIGO分期及分级的增加， bFGF的表达增加〔8〕。本研究表明CREB在肿瘤的进展中起着重要的作用。

Bcl-2基因即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因,其基因产物通过抵抗细胞凋亡,延长细胞寿命导致细胞数目增加,因此Bcl-2家族蛋白是多种肿瘤的存活因子，它的过表达与多种肿瘤的发生，进展，以及化疗药物的抵抗有关〔14〕。

研究表明，在恶性肿瘤中，Bcl-2的表达均比正常组织明显增高，如胃癌，卵巢癌等〔15，16〕。并且发现在胃癌，卵巢癌中，Bcl-2蛋白的阳性表达均与肿瘤的分期有关，与年龄以及肿瘤的分化程度没有关系〔15，16〕。与本研究结果一致。

在卵巢癌中，bFGF、CREB和Bcl-2的表达与肿瘤的临床病理特征的关系一直存在争议，这些研究之间的差异，一方面推测可能是统计的样本量有差别；另一方面国际上没有统一免疫染色的评分标准，搜集的病例不处于同一分期；另一方面可能由于应用免疫组织化学试剂、方法及实验条件不同，这些都可能造成研究结果存在差异。但研究结果均表明，与卵巢良性肿瘤及正常组织相比,卵巢癌中bFGF、CREB和Bcl-2的表达均明显增高。

4 参考文献

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