先天伏寒鼠模型的制备

郭家娟 张 爽 李亦男 黄永生

(长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130021)

黄永生教授在多年的临床诊治过程中，发现非常多的患者存在顽固性的足凉或手足凉的症状，这些患者通常会在不同年龄段规律性出现相似的病症〔1，2〕，针对这种证候的规律性，同时基于前人伏邪理论及《灵枢·天年》的理论假说〔3〕，创立先天伏寒病因学说，总结出先天伏寒证的病因病机及症候特点，提出诊治方案，组方用药应用于临床，取得满意的疗效。以此为基础，本课题组前期已完成“973计划中医伏邪病因学说的整理与创新研究”，初步规范了先天伏寒证的概念和诊疗，并证实临床辨证时如果能够针对先天伏寒病因特点进行治疗，会明显提高临床疗效。同时，课题组初步探索了先天伏寒的微观生物学指标，推测先天伏寒证候的亚健康人群具有潜在性炎症紊乱，同时还伴有神经内分泌系统功能低下。但因为临床上病人从先天不足、伏寒于内到临床发病，可能需要几十年的时间，所以目前深入研究先天伏寒致病的微观机制有一定难度。鉴于此，本实验以制备稳定的先天伏寒动物模型为目的，试图为先天伏寒病因理论提供科学依据。

1 材料与方法

1.1动物 4周龄雌性、雄性Wistar大鼠各25只，体重(23±2)g；正常6周龄10只Wistar大鼠，体重(30±2)g，雌雄各半。实验鼠均由吉林大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK-(J)2011-0003。

1.2药物 氢化可的松注射液(批号：13031011)，天津药业焦作有限公司。

1.3试剂及仪器 FAIO04电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司；酶联免疫检测仪，南京华东电子集团医疗装备有限责任公司；京立LDZ5-2离心机，北京医用离心机厂；TH-212智能数字测温仪，北京鸿鸥成运科技有限公司。

1.4方法

1.4.1给药及分组方法 氢化可的松腹腔注射，每只3.6 mg/100 g，连续14 d；同时附加寒冷因素：将大鼠分别置于2℃～4℃的冰水中游泳，5 min/次，1次/d，共14 d，制备肾阳虚大鼠模型。通过模型评估，证明成功的肾阳虚模型大鼠20只，雌雄各半。另取正常的6周龄Wistar大鼠10只，用摸球法随机平均分配至正常雄加阳虚雌组，阳虚雄加阳虚雌组，阳虚雄加正常雌组，每组5对，分别同笼产子。

1.4.2一般状态观察 先天伏寒症候表现类似肾阳虚，但其程度较肾阳虚更重〔1〕。一般状态观察包括体温，反应灵敏度，活动情况，体重变化，体态，皮毛光泽度，竖毛现象，是否怕冷，是否喜欢拥挤在一起，饮食、大小便情况等，并与肾阳虚大鼠的一般状态进行对比。

1.4.3指标测定 主要检测大鼠下血脑-垂体-肾上腺(HPA)轴相关指标，包括皮质醇(Cortisol)、促肾上腺皮质(ACTH)、三碘甲状原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、促甲状腺激素(TSH)。

2 结 果

2.1各组大鼠一般状态 在同笼产子过程中，阳虚雄加阳虚雌组从同笼开始到乳鼠产下平均耗时48 d，远长于正常雄加阳虚雌组和阳虚雄加正常雌组的平均耗时34 d，且阳虚雄加阳虚雌组有2对没有产子。先天伏寒鼠相比同周龄肾阳虚鼠体重稍有减轻，饮食减少，皮毛光泽度更差，竖毛现象更加明显，反应灵敏度下降，喜欢拥挤在一起相互取暖。

2.2四组大鼠生长至4周龄时口腔、上肢、下肢温度比较 新生鼠的口腔温度，上、下肢温度与肾阳虚大鼠及正常大鼠比偏低(P<0.01)。肾阳虚大鼠与正常大鼠比较下肢温度有显著差异(P<0.01)，口腔温度和上肢温度差异有统计学意义(P<0.05)。3组新生鼠口腔温度，上、下肢温度之间对比差异没有统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3各组大鼠Cortisol、ACTH、T3、T4、TSH水平比较 先天伏寒大鼠血清Cortisol、ACTH、T3、T4、TSH水平比肾阳虚大鼠均降低(P<0.05)，其中阳虚雄加正常雌组Cortisol、T4水平降低显著(P<0.01)。见表2。

表1 各组大鼠各部位温度比较℃)

表2 先天伏寒鼠与肾阳虚鼠血清激素水平比较

3 讨 论

本实验利用先天伏寒证“男女媾精，阳气不足，寒伏于内”的病机理论，从模型的母代入手，遵循先天伏寒证的形成原因制备动物模型，基本保持了与临床上先天伏寒证形成的一致性，因此能够较好反映先天伏寒证的实质。

本实验用肾阳虚鼠同笼产子，分别为父辈或母辈单方阳虚和父辈母辈双方皆阳虚。产子后通过观察新生鼠体温、体重、体态、皮毛光泽度、竖毛现象、是否怕冷、是否喜欢拥挤在一起、反应灵敏度、自主活动情况、饮食、大小便等中医症状为主导，结合分子生物学指标，对先天伏寒大鼠进行评价〔4～6〕。结果显示，先天伏寒证鼠体重比肾阳虚鼠低，增长速度更加缓慢，精神状态更加萎靡，活动度差，竖毛现象更加明显，饮水量增加，常喜欢拥挤在一起，常有稀便。

有研究显示，先天伏寒证患者可表现为HPA 轴功能及潜性炎症因子异常，其中炎性因子白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、高敏C反应蛋白(hs-CRP)水平均明显升高，血清Cortisol、ACTH水平均下降，且下降程度较肾阳虚患者更明显〔7，8〕。据此，我们推测先天伏寒鼠表现亦有相同趋势。结果显示，与同周龄肾阳虚鼠比较，先天伏寒鼠血清Cortisol、ACTH、T3、T4、TSH均降低，这是从分子生物学角度对模型组鼠一般状态进行了解释，从而确定先天伏寒动物模型制备成功。

另外，正常雄加阳虚雌组，阳虚雄加阳虚雌组，阳虚雄加正常雌组3组之间相互比较，大鼠的一般状态及血清Cortisol、ACTH、T3、T4、TSH水平差异不明显，但阳虚雄加阳虚雌组产子耗时长，产子数量少，不利于先天伏寒大鼠模型的复制，故推断正常雄加阳虚雌或阳虚雄加正常雌的组合方式更加适合先天伏寒鼠模型的制备。

4 参考文献

1黄永生，郭家娟.先天伏寒证理论内涵及其对临床指导意义〔J〕.实用中医内科杂志,2007;21(6)：3-4.

2崔英子，郭家娟，黄永生.从先天伏寒论治冠心病心绞痛126例临床观察〔J〕.中医杂志,2010;51(6)：516-9.

3任继学.伏邪探微〔J〕.长春中医学院学报，2005;21(1)：4-7.

4沈自尹.肾阳虚证的定位研究〔J〕.中国中西医结合杂志，1997；17(1)：50-2.

5周文江，姚菊芳.肾阳虚证大鼠模型的建立〔J〕.实验动物与比较医学，2007;27(4)：242-3.

6苟小军，韩宝侠，王朝廷,等.肾阳虚证造模方法考察〔J〕.吉林中医药，2009;2(9)：814-5.

7崔英子.从“先天伏寒”论治冠心病及其与神经内分泌免疫相关因子关系的研究〔D〕.长春：长春中医药大学，2010.

8魏 岩.冠心病心绞痛先天伏寒证代谢组学的初步研究 〔D〕.长春：长春中医药大学，2011.