党参水煎剂对亚急性衰老模型小鼠胸腺自由基代谢和细胞凋亡的影响

侯 茜 郭 美 张 帆

(甘肃中医学院生物教研室 甘肃中医学院系统生物学与中医药转化研究所 甘肃中医学院中西医结合基础学科重点实验室，甘肃 兰州 730000)

免疫系统的衰老是机体衰老的主要原因〔1〕。而免疫衰老是以胸腺衰老为先导的从中枢到外周的衰老进程，胸腺衰老可以作为免疫衰老最重要的标志〔2〕。因此，在抗衰老研究中，保护胸腺，延缓胸腺萎缩具有不可替代理论和实际意义。胸腺细胞过度凋亡是胸腺萎缩的重要因素〔3〕，而活性氧自由基与细胞凋亡密切相关〔4〕。党参主治脾肺虚弱，气短心悸，食少便溏，热病伤津，虚喘咳嗽，内热消渴等症，可以作为人参的替代品〔5〕。现代研究发现，党参具有增强免疫力、抗氧化、抗缺氧、抗疲劳、抗肿瘤、增强记忆和提高学习能力等功能〔6〕。目前，关于党参延缓免疫衰老的研究还未见报道。现代研究已证实，D-半乳糖可以诱导免疫衰老，是有效的免疫衰老研究模型〔7〕。本实验通过观察党参水煎剂对亚急性衰老模型小鼠胸腺组织大体形态结构、组织自由基代谢和胸腺细胞凋亡率方面的影响，研究其抑制胸腺萎缩，延缓免疫衰老的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级昆明种小鼠100只，雄性，2月龄，体重(20±2)g，购自甘肃中医学院实验动物中心。

1.2药品试剂及仪器 党参：产自甘肃文县，经甘肃中医学院药学系晋玲教授鉴定为优质道地药材。制成含生药浓度为1 g/ml的水煎剂，置4 ℃备用；D-半乳糖：上海中秦试剂有限公司，批号20111220；维生素E软胶囊：青岛双鲸药业有限公司，批号110608；考马斯亮蓝蛋白浓度、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号111203；其余试剂均为国产分析纯试剂。BS224S电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；Feb-80台式高速离心机：金坛市恒丰仪器厂；OLYMPUS BX60光学显微镜：JAPAN；VIS-723N可见分光光度计：北京瑞克分析仪器公司；EPICS XL流式细胞仪：美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3动物分组 小鼠随机分为5组，空白对照组、衰老模型组、维生素E组、党参低剂量组和党参高剂量组，每组20只。

1.4造模及给药 每日每只小鼠颈背部皮下注射5%D-半乳糖溶液，注射量为1 000 mg/kg，空白对照组注射等量生理盐水，共42 d。从造模第11天开始党参高、低剂量组每日上午分别按相当于生药量15 g/kg和5 g/kg灌服党参水煎剂，维生素E组灌胃给予维生素E溶液50 mg/kg，空白对照组和衰老模型组给予等量生理盐水灌胃。按体重调整给药量，连续30 d。

1.5观察指标与测定

1.5.1光镜观察胸腺组织病理变化 采用颈椎脱臼法处死小鼠，迅速剖取胸腺，取一叶胸腺立即投入10%甲醛溶液中固定。取固定好的胸腺组织经石蜡包埋、切片、HE染色后，镜下观察组织大体形态变化。

1.5.2胸腺组织MDA含量及SOD活性的测定 采用颈椎脱臼法处死小鼠，迅速剖取胸腺，去除周围脂肪组织，预冷生理盐水洗净血液，吸干水分并称重，加9倍体积的预冷生理盐水，采用手工匀浆法制成10%的胸腺组织匀浆，操作在冰水浴中进行，3 000～4 000 r/min离心10 min，取适量上清液，按试剂盒说明进行操作。按公式计算出各组小鼠胸腺组织蛋白浓度、MDA含量及SOD活性。

1.5.3胸腺组织细胞凋亡率的测定 采用颈椎脱臼法处死小鼠，迅速剖取胸腺，用PBS漂洗除去血液，将组织置于培养皿内，加适量PBS，用眼科剪剪碎，加0.25%Trypsion-EDTA溶液等体积与组织混合，室温下搅动10～20 min，过200目尼龙网，将细胞悬浮于含1%胎牛血清的PBS中，混匀，1 000 r/min 离心5 min，去上清，将细胞重新悬浮于含1%胎牛血清的PBS中，再经PBS洗1次后将细胞悬浮起来，用加样器将细胞悬液打入75%冷乙醇中混匀封口，置于4 ℃冰箱中固定12 h。然后取出，1 500 r/min离心5 min，PBS洗2次，加RNAase(0.5 mg/ml)消化，37 ℃ 30 min，加入PI(25 μg/ml)染色，避光20 min，流式细胞仪检测，计算G0/G1期之前的A0峰(凋亡峰)，以峰值面积计算凋亡量。

1.6统计学方法 采用SPSS19.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1党参水煎剂对胸腺组织形态的影响 空白对照组：胸腺皮质与髓质分界清晰，皮质较厚，胸腺细胞排列整齐，网状细胞较少；髓质染色浅，淋巴细胞较少而稀，上皮网状细胞较多而显著，可见胸腺小体。衰老模型组：胸腺皮质与髓质分界不清，皮质较薄，胸腺组织中脂肪显著增加，局部出现纤维化，细胞排列紊乱，胸腺细胞明显减少。维生素E组：胸腺组织形态接近空白对照组，皮质与髓质界线明显，皮质较厚，胸腺细胞数量明显增加。党参低剂量组：胸腺组织形态介于空白对照组与衰老模型组之间，皮质与髓质分界较明显，部分区域皮质较薄，胸腺细胞排列不齐，数量减少。党参高剂量组：胸腺组织形态接近空白对照组，与维生素E组类似，皮质与髓质分界明显，皮质较厚，胸腺细胞数量明显增加。见图1。

2.2党参水煎剂对亚急性衰老小鼠胸腺组织MDA含量和SOD活性的影响 与空白对照组比较，衰老模型组和党参低剂量组小鼠胸腺MDA含量显著增高(P<0.05)，SOD活力下降(P<0.05)；与衰老模型组比较，维生素E组、党参低剂量组和党参高剂量组小鼠胸腺MDA含量显著下降(P<0.05)，SOD活力显著增加(P<0.05)；与维生素E组比较，党参高剂量组MDA含量和SOD活力值无明显差异(P>0.05)，党参低剂量组介于维生素E组和衰老模型组之间。见表1。

衰老模型组

维生素E组

党参低剂量组

党参高剂量组

与空白对照组比较：1)P<0.05；与衰老模型组比较：2)P<0.05

2.3党参水煎剂对亚急性衰老小鼠胸腺组织细胞凋亡率的影响 与空白对照组〔(1.34±0.28)%〕比较，衰老模型组胸腺细胞凋亡率显著增加〔(14.91±0.83)%，P<0.05〕，维生素E组、党参低剂量组和党参高剂量组凋亡率有下降趋势〔(3.38±0.36)%、(4.90±0.32)%、(3.85±0.23)%〕但与空白对照组相比亦有显著差异(P<0.05)；与衰老模型组比较，各组小鼠胸腺细胞凋亡率均明显降低(P<0.05)；与维生素E组比较，党参高剂量组无显著差异(P>0.05)。

3 讨 论

自由基又称游离基，是在体内氧化代谢过程中产生的，它作为一种氧化剂，对生物大分子如蛋白质、脂类、核酸等均有破坏作用，还可通过改变血液流变特性，引起微循环障碍导致局部缺血，使细胞处于缺氧状态而受损〔8〕。同时，机体内存在自由基抗氧化酶防御系统，及时清除产生的自由基，保持体内自由基的产生和清除始终处于动态平衡。但当机体抗氧化酶活性下降时，体内产生的自由基得不到及时的清除，进而导致退行性疾病、肿瘤及衰老等现象的发生。

细胞凋亡是保持自身组织稳定、调控自身细胞的增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞主动性死亡过程〔9〕。细胞凋亡对衰老的影响主要表现在：一是通过凋亡的形式清除功能障碍或受损的细胞，并由纤维组织代替，维持机体内环境的稳定；二是清除不可再生的细胞，清除后不能由其他组织替代，进而导致病理改变。因此，细胞凋亡增加将导致组织细胞数量减少，功能减退而出现老年性进行性病理过程〔10〕。胸腺细胞凋亡率增加是影响胸腺萎缩的重要因素之一。

自由基与细胞凋亡有着密切的联系。在诸多凋亡的诱因中，体内代谢或外源性因素产生的自由基均被证实可诱导细胞凋亡，大量研究表明自由基参与了细胞凋亡过程〔4〕。自由基代谢失衡和细胞凋亡过度均是影响衰老的重要因素。

本实验结果表明，党参水煎剂可通过改善胸腺组织病理形态、平衡自由基代谢和降低细胞凋亡率几方面起到延缓胸腺萎缩，增强机体免疫功能，延缓衰老的作用。胸腺组织自由基代谢恢复平衡状态可能是细胞凋亡率降低的影响因素之一。

4 参考文献

1Miller AR.Aging and immune function:cellular and biochemical analyses 〔J〕 .Exp Gerontol,1994；29(1):21-35.

2王 通，曾耀英.胸腺保护与抗衰老 〔J〕.中国临床康复，2005；9(23)：164-6.

3龚张斌.胸腺衰老与免疫衰老〔J〕.国外医学·老年医学分册，2009；30(4):145-9.

4王新玲，李彩月，侯颖春.自由基、细胞凋亡与衰老关系的研究进展〔J〕.中国老年学杂志，1999；19(4)：252-3.

5国家药典委员会.中华人民共和国药典〔M〕.北京:化学工业出版社，2005：199.

6李黎星，康杰芳.中药党参的研究进展〔J〕.现代生物医学进展，2009；9(12)：2371-3.

7Wei HF,Li L,Song QJ,etal.Behavioural study of the D-galactose induced aging model in C57BL/6J mice 〔J〕.Behav Brain Res,2005;157(2):245-51.

8Ershler WB,Long DL.The biology of aging:the current research agenda〔J〕.Cancer,1997;80(7):1284.

9Vaux DL.Toward and understanding of the molecular mechanism of physiological cell death〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:786.

10Warner HR,Hodes RJ,Pocinki K.What does cell death have to do with aging〔J〕.Am Geriatr Sec,1997;45(1):140.