PAI-1基因4G/5G多态性、FⅦ基因R353Q多态性与冠心病的相关性

赵晓辉 刘 鹏 葛 斌 靳凤琳 韩子强

(泰山医学院附属医院心内一科，山东 泰安 271000)

冠心病(CHD)是由多基因遗传因素及环境因素共同作用引起的一种复杂的疾病，血液凝溶系统失衡在CHD的发病过程中所起的作用不容忽视。PAI-1是纤溶系统关键的调节因子，起着决定性作用，PAI基因的很多位点存在多态性，其基因多态性中4G/5G多态性与CHD关系密切目前国外心血管领域以4G/5G插入或缺失多态性研究较多考虑到人种不同及比较均衡的因素不同，PAI基因多态性与CHD及CHD危险因素之间的关系需要进一步研究证实。国外研究报道血浆FⅦ活性(FⅦC)增高是CHD发生的危险因素〔1，2〕。 凝血因子在外源性凝血途径中起关键作用，但其他研究组未能重复出类似的研究结论,可能由于血液中FⅦC的测定易受饮食、运动和药物治疗等因素的影响,因此FⅦ 基因多态性研究也许可以提供一条新的途径。

1 对象与方法

1.1对象 病例选自2010年4～10月泰山医学院附属医院的心内科病房。CHD患者146例，男98例，女48例，年龄为(65±10)岁，甘油三酯〔TG，(1.84±1.58)mmol/L〕，血糖〔BS，(6.05±2.34)mmol/L〕，高密度脂蛋白〔HDL，(1.24±0.41)mmol/L〕，收缩压〔SBP，(137.21±21.50)mmHg〕。病例符合1979年世界卫生组织(WHO)关于缺血性心脏病的命名和诊断标准〔1〕，部分病例经冠状动脉造影确诊〔2〕。冠脉造影时，各主要分支存在>50%狭窄定义为有意义病变，113例正常人选自人群健康体检的随机个体本研究人群个体之间无血缘关系作为对照，排除冠心病糖尿病高血压患者，男71例，女42例，平均年龄(64±8)岁，TG(1.29±0.57)mmol/L，BS(5.18±0.94)mmol/L，HDL(1.35±0.39)mmol/L，SBP(128.04±14.02)mmHg。

1.2基因型的确定 采用PCR-RFLP技术进行基因型分析，酚-氯仿法提取外周血基因组DNA， PAI-1基因参考Margaglione等〔3〕设计引物，由海上生工(Sangon公司)合成，上游引物序列5′-CACAGAGAGAGTCTGGCCACGT-3′;下游引物序列为5′-CAGCCACTGGATTGT-CTAGGT-3′， FⅦ基因参考Bernardi等〔4〕设计引物，上游引物序列5′-TGATGACCCA-GGACTGCCT-3′，下游引物序列为5′-GGATTTGGTGCCAGGACAG-3′，由上海生工(Sangon公司)合成。反应体系25 μl,其中含10倍PCR缓冲液2.5 μl，MgCl21.2 mmol/L，DNTP 0.24 mmol/L，模板DNA 0.12 μg，Tap酶1 U。上下游引物各0.75 μmol。扩增条件：94 ℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环后，72℃延伸5 min，取5 μl PCR产物，加入10倍Buffer 2 μl，FⅦ基因PCR产物经MspⅠ酶切，PAI-1基因PCR产物经BSⅡ酶切，限制性内切酶1 μl，去离子水12 μl，55℃酶切3 h，酶切产物用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色检测，确定基因型。

1.3统计学分析 资料用SAS软件行t及χ2检验；应用非条件Logistic回归模型，对各原始变量采用逐步法建模。

2 结 果

2.1酶切产物的判定 PAI-1基因PCR产物为142 bp经BSⅡ酶切消化后产生不同的特异性片段，形成3种基因型：4G/4G基因型：只存在一个基因酶切位点，产生96 bp和46 bp 2条带；5G/5G基因型：存在2个酶切点，产生74 bp、46 bp和22 bp 3条带；4G/5G基因型：同时具有96 bp、74 bp、46 bp和22 bp 4条带。其中22 bp条带在10% PAG胶电泳中跑出，见图1。

FⅦ基因PCR产物为312 bp经MspⅠ酶切消化后产生不同的特异性片段，形成3种基因型： RR基因型产生 206 bp、67 bp和39 bp三种片段，RQ基因型产生 273 bp、206 bp、67 bp和39 bp四种片段，QQ基因型有273 bp和39 bp两种片段，见图2。

2.2PAI-1基因型和等位基因频率分布 如表1所示，4G/4G、4G/5G、5G/5G三种基因型和等位基因频率病例和对照组间无显著差异(χ2=4.52，P=0.11；χ2=2.17，P=0.14)；相比与含有5G等位基因的基因型，4G/4G基因型分布在病例和对照组间有显著差异(χ2=4.05，P=0.44)。

1～8：5G/5G，4G/5G，5G/5G，4G/5G，4G/4G，4G/4G，4G/4G，5G/5G

1～9：RR，PQ，RR，RR，RQ，QQ，RR，QQ，RR，RR

表1PAI-1基因型和等位基因频率分布〔n(%)〕

组别n基因型5G/5G4G/5G4G/4Gχ2值P值5G/5G+4G/5G4G/4Gχ2值P值等位基因频率(%)5G4Gχ2值P值CHD组14632(21.9)68(46.6)46(31.5)4.5190.114100(68.5)46(31.5)4.0540.04445.254.82.1660.141对照组11333(29.2)57(50.4)23(20.4)90(79.6)23(20.4)54.445.6

2.3PAI-1基因型与CHD 与5G/5G相比，4G/5G，4G/4G的OR随4G等位基因的增加呈增加趋势，并且与含5G等位基因的基因型相比，4G/4G基因型与冠心病的病因关联指标有统计学意义(P=0.04)，提示4G/4G基因型与冠心病的危险性相关(P<0.05)。4G/4G基因型的OR值为2.06，即表明具有4G/4G基因型比具有5G/5G基因型的人患冠心病的危险性增加2.06倍(95%CI：1.03～4.14)，见表2。

2.4FⅦ基因型与CHD FⅦ基因型分布病例组与对照组相比无显著差异(P>0.05)，本实验QQ基因型较少，结合QQ+PQ基因型频率与RR型相比，FⅦ基因型分布病例组与对照组相比亦无显著差异(P>0.05)。上述各组R、Q等位基因频率相比，CHD组与对照组亦无显著差异(P均>0.05)。见表3。用Logistic回归分析FⅦ基因型与CHD危险性间的关系发现，尽管Q等位基因有使得CHD患病降低的趋势但尚未达到统计学意义(β=-0.204，SE=0.407，P=0.617，95%CI=0.37～1.81)。

表2 PAI-1基因型与CHD危险性的关系

表3 FⅦ基因型与等位基因频率分布〔n(%)〕

3 讨 论

目前CHD被认为是多种遗传和环境因素相互作用所致的复杂的多基因遗传病。国外资料显示，PAI-1基因主要有三种多态性与血管病变有关：4G/5G插入或缺失多态性、二核苷酸(C-A)n重复序列多态性、HindⅢ限制性片段长度多态性(RFLP)，目前国外心血管领域以4G/5G插入或缺失多态性研究较多〔4～6〕。经过对本研究人群资料的计算，正常人、CHD组PAI-1基因型频率分布均符合HarDY-Weinberg平衡〔7，8〕，说明本研究人群具有群体代表性，不存在选择偏倚。本研究与Mansfield等〔9〕研究结果一致，其作用的机制可能4G/4G基因型显著影响PAI-1的活性，血浆PAI-1活性增高引起纤溶活性降低,导致纤维蛋白清除减少,引起纤维蛋白沉积;同时,PAI-1抑制血管外基质的水解,限制血管外平滑肌迁移;另外,纤维蛋白与血管壁结合,通过刺激平滑肌细胞增殖而促进动脉粥样硬化斑块的生长。广泛动脉粥样硬化引起血管内皮细胞损伤，导致PA合成能力降低，储存、释放减少；内皮细胞受损后，血管平滑肌细胞浸润、增生、合成和分泌大量的PAI-1；激活的血小板释放大量的PAI-1进一步抑制了PA，血中PAI-1增多；PA减少，PAI-1的增多，血液运输功能下降，加重内皮损伤，形成恶性循环。另外本实验未发现基因型与心肌梗死的关系，虽然4G/4G基因型相比与非4G/4G型(4G/5G+5G/5G)，有使心肌梗死发病升高的趋势，但尚未达到统计学意义，与Eriksson等〔10〕研究结果不相符。此外PAI-1基因4G/5G多态性与冠脉病变程度，以及冠脉支架术后在狭窄率的关系如何需进一步研究明确。本研究将RQ和QQ联合分析，与RR基因型相比，RQ+QQ型有使冠心病，心肌梗死发病危险性降低的趋势，但都未达到统计学意义，这一结果的得出可能与种族有关。

4 参考文献

1Bernard R，Corday E，Eliash H,etal.Nomenclature and criteria for diagnosis of ischemic heart disease〔J〕.Circulation,1979;59(3):607-9.

2Gensini GG.Coronary arteriography in heart disease-A text blood of cardio-vascular medicine〔M〕.2nd ed.Philadelphia:Saunders，1984：304-50.

3Margaglione M，Grandone E，Vecchione G,etal.Plasminogen activator inhibit- tor-1(PAI-1) antigen plasma levels in subjects attending a metabolic ward：relation to polymorphisms of PAI-1 and angiontensin converting enzyme (ACE) genes 〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,1997；17:2082-7.

4Bernardi F，Arcieri P，Bertina RM,etal.Contribution of factor Ⅶ genotype to activated FⅦ level: differences in genotype frequencies between northen and southern European populations〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,1997;17(11):2548-53.

5Gardemann A，Lohre J，Katz N,etal.The 4G/4G genotype of the plasminogen activator inhibitor 4G/5G gene polymorphism is associated with coronary atherosclerosis in patients at high risk for this disease〔J〕. Thromb Haemost，1999；82(3)：1121-6.

6Visanji JM，Seargent J，Tahri D,etal.Influence of the 4G/5G dimorphism of the plasminogen activator inhibitor 1 promoter on thrombotic risk in patients with factor V Leiden〔J〕.Br J Haematol,2000；110(1):135-8.

7Schaid DJ，Sommer SS.Genotype relative risks：methods for design and analysis of candidate-gene association studies〔J〕.Am J Hum Genet，1993;53(5)：1114-26.

8冯 波.医学遗传学〔M〕.上海：上海科学技术文献出版社， 2001:143-57.

9Mansfield MW，Stckland MH，Grant PJ.Environmental and genetic factors in relation to elevated circulating levels of plasminogen activator inhibitor-1 in Caucasian patients with non-insulin-dependent diabetes mellitus〔J〕.Thromb Haemost,1995;74(3):842-7.

10Eriksson P，Kallin H，Vent Hooft FM,etal.Allele specific increase in basal transcription of the plasminogen activator inhibitor-1 gene is associated with myocardial infarction〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1995;92(6):1851-5.