RNAKL及其相关因子在中耳胆脂瘤患者瘤组织中的分布和表达水平

杨 琴 万 明 蒋正举 王正龙 赵 晓

(遵义医学院附属医院耳鼻喉科，贵州 遵义 563003)

临床常根据胆脂瘤发病位置分为颅内胆脂瘤、胆脂瘤型中耳炎及外耳道胆脂瘤等几类，系异位胚胎残余的外胚层组织的良性肿瘤〔1〕。虽然胆脂瘤是良性病变，但其具有恶性肿瘤生物行为，对中耳、颞骨等存在广泛损伤，而破骨细胞分化因子(RANKL)、配体核因子-κB受体活化因子(RANK)和骨保护素(OPG)在这一过程中扮演着重要角色〔2〕。本文旨在探究胆脂瘤骨质破坏与RANKL、RANK和OPG之间的联系。

1 资料与方法

1.1一般资料 我院耳鼻喉科2010年4月至2013年8月中耳胆脂瘤患者28例。男13例，女15例、年龄60～67岁，平均年龄(60.5±5.6)岁；病程3个月～2年，平均(11.2±5.4)个月。纳入标准：①胆脂瘤患者均经过术前高分辨率CT检查及术后病理学确诊；②均为第一次接受治疗。排除标准：胆脂瘤伴有耳道其他病变、手术前接受过相关药物治疗的患者。正常组20例，男8例，女12例；年龄61～68岁，平均年龄(61.7±5.8)岁；两组年龄、性别差异不具有统计学意义(P>0.05)。

1.2免疫组织化学检测方法 武汉博士德生物工程有限公司生产的兔抗人RANKL和OPG多克隆抗体；北京中杉生物技术有限公司生产的DAB显色试剂盒及免疫组织化学SP试剂盒。将新鲜标本快速置于中性甲醛溶液内充分固定，常规包埋，并行连续切片操作。染色操作按试剂说明书进行：标本脱蜡水化后，选用过氧化氢甲醛阻断内源性过氧化物酶活性，再行PBS修复抗原，并应用非免疫性山羊血清封闭，加入OPG多克隆兔IgG抗体一抗，于4℃温箱内过夜，加入生物素标记二抗，常温内孵化25 min，苏木精染色，树胶封片，于显微镜下检测RANKL、RANK、OPG、肿瘤坏死因子受体(TNFR)1表达情况。

1.3骨质破坏程度的判定 手术过程中：观察胆脂瘤对骨质的破坏程度，轻度：鼓室盾板和听骨遭到轻微破坏；中度：天盖和听骨大部分被破坏；重度：听骨完全破坏，迷路破坏，外耳道后壁破坏，面神经遭到破坏。

1.4统计方法 采用SPSS10.0软件进行t检验、Spearman秩相关检验。

2 结 果

2.1两组破骨细胞分化因子等指标的差异 病例组RANKL、OPG、RANK、RANKL/OPG、TNFR1水平均显著高于正常组(P<0.05)。见表1。

2.2RANKL/OPG与TNFR1的相关性 RANKL/OPG与TNFR1呈显著的正相关(r=0.497，P=0.007)。见图1。

2.3骨质破坏程度观察结果 术中观察发现：轻度骨质破坏9例、中度12例、重度7例。骨质破坏程度与RANKL/OPG比值呈正相关(r=0.602，P=0.000)。

表1 两组RANKL、OPG、RANK、RANKL/OPG、TNFR1表达比较±s)

图1 RANKL/OPG与TNFR1的相关性

3 讨 论

中耳胆脂瘤是一种多发于中鼓室、上鼓室、乳突或岩尖区域内的胆脂瘤，是鳞状上皮异常积聚，其对患者中耳听力结构及相邻颅骨存在极大破坏，患者可能出现长期流脓、鼓膜穿孔以及听力下降等症状〔3〕。临床将中耳胆脂瘤分为先天性及后天性两类，其中先天性中耳胆脂瘤发病由形成原始脊索相同的外胚层胚胎细胞残留的异常集聚而成〔4〕。而后天性中耳胆脂瘤又可细分为后天原发性胆脂瘤及后天继发性胆脂瘤两类，其中后天原发性中耳胆脂瘤发病机制可能与咽鼓管功能障碍引发的鼓膜内陷袋诱发的上皮碎屑堆积有关；后天继发性胆脂瘤则与外伤、手术损伤引发的鳞状上皮细胞中耳种植有关〔5〕。中耳胆脂瘤患者最为危险的症状即为中耳听力结构及相邻颅骨破坏，而这种骨破坏与破骨细胞活化水平有关，而RANKL、RANK和OPG则为破骨细胞的重要参与物质。

临床业已证实成骨细胞和破骨细胞间的平衡关系是骨形成和吸收的重要影响因素。RANKL是人体骨吸收的重要因子，其是核因子-κB配体的受体活化物，归属于TNF家族，其主要通过活化的T淋巴细胞及成骨/基质细胞来表达〔6〕。一般而言，表达于成骨细胞的RANKL可于巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)环境内与表达于破骨细胞的特异性受体RANK结合，进而调控破骨细胞分化、生存以及附着功能，最终实现骨吸收〔7〕。但上述机制可被OPG抑制，OPG是一种生长因子受体，其归属于TNF家族，该物质主要表达于骨髓基质细胞和成骨细胞内，其他如：成纤维细胞、树突细胞、主动脉平滑肌细胞、单核细胞内也存在少量表达〔8〕。OPG可与RANK竞争性结合RANKL，而骨组织微环境内的OPG与RANKL相对水平是影响破骨细胞活化、增殖的关键，RANKL/OPG比值大小直接影响着该区域骨骼以骨破坏表达或骨生成表达，这一途径被医学界称为RANKL-RANK-OPG通路〔9〕。已有研究表明，骨破坏相关因子与部分激素可调节RANKL与OPG的表达水平，进而影响患者骨代谢，如维生素D3、甲状旁腺素、IL-11、IL-1等可上调RANKL表达，进而激活破骨细胞；而前列腺素E2则可下调OPG表达并激活破骨细胞〔10〕。

本研究表明中耳胆脂瘤患者存在较为明显的RANKL-RANK-OPG通路激活。RANKL/OPG比值越高患者破骨细胞活化程度越高，患者中耳听力结构及相邻颅骨损伤也越严重。临床可根据患者RANKL、OPG及RANKL/OPG表达情况给予患者诊断及治疗介入。

4 参考文献

1张 娜,段春红,刘 敏,等. 不同浓度破骨细胞分化因子和1，25-(OH)2D3体外诱导大鼠破骨样细胞形成的研究〔J〕. 中国药物与临床,2014;1(5):597-9.

2王生瑜,袁小平. 甲状旁腺素对大鼠正畸牙根吸收后修复期破骨细胞的影响〔J〕. 重庆医学, 2013;1(30):3644-6.

3刘长庚,罗启贤,凌天牖,等. 灯盏花对成骨细胞及破骨前体细胞OPG/RANKL/RANK表达的影响〔J〕. 中国中西医结合杂志, 2013;33(12):1658-64.

4熊 琦,张里程,张立海,等. 重组人骨保护素与重组核因子κB活化因子受体蛋白对破骨前体细胞分化的影响〔J〕. 中国骨伤, 2013;26(4):324-7.

5Xia M,Ding SL,Zhang HB,etal. Expression and significance of nuclear factor-kappa Bligand and correlation factor in the tissue of otitis media with cholesteatoma〔J〕.J Clin Otorhinolaryngol Head Neck Surg,2007;21(7):315-7.

6刘 辉,Bargouti M,郑召民,等. LIM矿化蛋白-1抑制破骨前体细胞合成一氧化氮的分子机制研究〔J〕. 中华骨科杂志, 2011;31(5):520-9.

7王 信,汪 洋,朱勇军,等. 诱导小鼠破骨前体细胞成熟分化的实验条件探讨〔J〕. 中国骨质疏松杂志, 2011;17(3):190-4.

8张 娟,许 卓,尹立全,等.腰椎管内胆脂瘤术后综合康复治疗1例〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(2):393-4.

9Sudhoff H, Liebehenz Y, Aschenbrenner J. Expression of osteoclast stimulating and differentiating factors in a murine model of localized inflammatory bone resorption〔J〕. Laryngo Rhino Otologie, 2004;83(1):14-9.

10赵忠赢,白 杨,王世强,等.老年颅内胆脂瘤临床特点及神经内镜辅以显微神经外科手术的疗效〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(7):1704-5.