辛伐他汀对氧化型低密度脂蛋白刺激SMC增殖的抑制作用

刘 凯 严梦彤 瑞 塔 孙 波 苗春生 李相军 任立群

(吉林大学药学院实验药理与毒理教研室，吉林 长春 130021)

他汀类药物已成为预防与治疗心血管疾病中不可或缺的一部分。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是经低密度脂蛋白(LDL)氧化而来，是目前公认的导致动脉粥样硬化(AS)的重要因子。研究显示，ox-LDL可通过多种途径诱导血管内皮细胞及平滑肌细胞(SMC)的增殖与凋亡〔1～3〕。辛伐他汀可用于控制血液中胆固醇的含量以及预防心血管疾病，能有效降低心血管疾病、脑卒中等疾病的发生〔4〕。尽管辛伐他汀已成为常用的降血脂及预防AS的药物，但其机制尚不明了。本研究主要探讨辛伐他汀对致AS的主要效应细胞——主动脉SMC增殖的影响。

1 材料与方法

1.1材料 SMC购于中国科学院上海生命科学研究院细胞生物研究所，低糖DMEM培养基购于赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司，标准胎牛血清购于天津市灏洋生物制品科技有限公司，噻唑蓝(MTT)、胰蛋白酶(1∶250)购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，二甲基亚砜(DMSO)购于天津市北联精细化学品开发有限公司。

1.2细胞培养传代 从液氮中取出细胞冻存管，迅速放入37℃的水浴中，使细胞快速融化，用无菌吸管将细胞液转入50 ml培养瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基10 ml，轻轻摇匀后放入37℃、5%CO2的培养箱中孵育。待细胞长至80%～90%时，进行常规传代与培养。

1.3实验分组 实验分为对照组、模型组、辛伐他汀低、中、高剂量组。对照组用常规无血清培养液培养，模型组用含100 mg/L ox-LDL的无血清培养液，辛伐他汀低、中、高剂量组分别用含辛伐他汀终浓度为1、2、4 μmol/L的100 mg/L ox-LDL的无血清培养液。

1.4MTT法检测细胞增殖能力 将处于对数生长期的细胞常规消化、接种至96孔板，接种密度为1×103/孔，待细胞完全贴壁后，换用无血清DMEN培养基继续培养24 h使细胞生长同步化。吸弃培养液，按1.3所述分别加入条件培养液继续培养24 h后，每孔加入20 μl 5 mg/L MTT贮存液继续培养3 h。吸弃上清，每孔加入150 μl DMSO以溶解沉淀，于490 nm处测定每孔OD值。每组设6个复孔，重复3次。

1.5流式细胞术(FCM)检测细胞周期 将处于对数生长期的细胞常规消化、接种至6孔板，接种密度为5×105/孔，待细胞完全贴壁后，换用无血清DMEN培养基继续培养24 h使细胞生长同步化。吸弃培养液，按1.3所述分别加入条件培养液继续培养24 h后吸弃上清，加入0.25%胰酶消化，1 000 r/min，5 min离心收集细胞，弃上清用预冷PBS洗细胞3次，离心弃上清，加入预冷70%乙醇于4℃过夜。1 000 r/min，5 min离心弃乙醇，用预冷PBS重悬细胞5 min。离心弃上清，加入浓度为50 μg/ml的碘化丙啶(PI)1 ml 4℃避光孵育30 min，上机检测。

1.6统计学分析 采用SPSS19.0软件，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用最小显著差异(LSD)法。

2 结 果

2.1细胞增殖能力检测结果 MTT结果显示，与对照组(0.91±0.12)比较，ox-LDL模型组细胞增殖现象明显增高(1.47±0.12)(P<0.01)，与ox-LDL模型组比较，辛伐他汀高、中、低剂量组均明显降低(分别为1.02±0.10、1.13±0.08、1.29±0.11)(P<0.05，P<0.01)，辛伐他汀各剂量组间细胞增殖能力未见显著差异。

2.2细胞周期检测结果 FCM结果显示，在G1/G0及G2/M期，各组细胞比较无显著性差异。与对照组比较，模型组细胞S期比例明显增加(P<0.01)，蛋白合成期差别不大，但是S期DNA复制期比例明显增加(P<0.01)。与模型组比较，辛伐他汀高、中剂量组S期细胞所占比例明显降低(P<0.01)，见表1。

表1 流式细胞术测细胞周期±s,%,n=6)

3 讨 论

目前认为，ox-LDL可通过损伤内皮细胞、参与泡沫细胞形成、调控血管SMC增殖等多个方面诱导AS的发生，因此，ox-LDL在AS形成过程中具有十分重要的作用。ox-LDL可通过活性氧的聚集刺激细胞外信号调控激酶磷酸化，随即刺激血管内皮转录因子激活蛋白和内皮素的分泌和表达；ox-LDL还可以抑制前列环素(PGI2)的分泌来共同调控SMC的增殖〔5，6〕。此外，ox-LDL还可刺激内皮细胞释放血小板源生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及转化生长因子-β(TGF-β)的表达，进而参与SMC增殖的调控〔7〕。本研究结果显示，100 mg/L的ox-LDL可明显刺激体外培养人SMC增殖，与以往研究结果相似。细胞周期分析结果显示，加入ox-LDL后，S期细胞比例明显增加，提示ox-LDL可能通过刺激DNA合成，从而促进细胞分裂增殖。他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶HMG-CoA还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面LDL受体数量和活性增加，使血清胆固醇清除增加、水平降低，是目前常用的降血脂药。除降血脂作用外，辛伐他汀可能还具有改善血管内皮功能、抑制血栓形成、抗炎、抗氧化和稳定动脉粥样硬化斑块等作用。本研究结果显示，辛伐他汀可直接抑制ox-LDL介导的细胞增殖作用，这可能是其延缓AS发生发展及稳定AS斑块的机制之一。FCM结果分析显示，辛伐他汀抑制SMC过度增殖作用可能与辛伐他汀能明显抑制ox-LDL介导的S期细胞数量增加、抑制S期细胞DNA合成有关，其具体机制尚待深入研究。

4 参考文献

1Chen TC，Chen TL，Chang HC，etal.Oxidized low-density lipoprotein induces apoptotic insults to mouse cerebral endothelial cells via a Bax-miochondria-caspase protease pathway〔J〕.Taxicol Appl Phamacol，2007；219(1)：42-53.

2Liu X，Zhao J，Xu J，etal.Protective effects of a benzoxazine derivative against oxidized LDL-induced apoptosis and the increases of integrin beta4，ROS，NF-kappaB and P53 in human umbilical vein endothelial cells〔J〕.Bioorg Med Chen Lett，2009；19(10)：2896-900.

3Ou HC，Chou FP，Sheu WH，etal.Protective effects of magnobl against oxidized LDL-induced apoptosis in endothelial cells〔J〕.Arch Taxicol，2007；81(6)：421-32.

4刘 冰，柯永胜.他汀类药物强化调脂改善冠状动脉粥样硬化的研究进展〔J〕.实用心脑肺血管病杂志，2013；21(3)：6-7.

5张 良，韩 丹，赵诗萌，等.OX-LDL与单核巨噬细胞相互作用促进动脉粥样硬化形成〔J〕.中国比较医学杂志，2013；23(4)：31-6.

6Xu H，Duan J，Wang W，etal.Reactive oxygen species mediate oxidized low density lipoprotein induced endothelin 1 gene expression via extracellular signal regulated kinase in vascular endothelial cells〔J〕.J Hypertens，2008；26(5)：956-63.

7Kona S，Chellamuthu P，Xu H，etal.Effects of cyclic strain and growth factors on vascular smooth muscle cell responses〔J〕.Open Biomed Eng，2009；3(1)：28-38.