四君子汤和理中汤对脾虚肠易激综合征大鼠一氧化氮信号通路及胃动素表达影响的差异

段永强 程卫东 李兰珍 成映霞 程 容 杨晓轶 张 晶 杜 娟

(兰州大学基础医学院中西医结合研究所，甘肃 兰州 730020)

肠易激综合征(IBS)是由于肠道动力学和内脏感觉异常所导致的胃肠道功能性疾病，以持续存在或间歇发作的排便习惯改变、粪便性状异常(稀便、黏液便)、腹胀及腹痛等为表现的临床综合征。流行病学研究表明我国IBS患病人群以腹泻型为多发，由于IBS缺乏可解释症状的形态学改变和生化异常〔1〕，故目前认为腹泻型肠易激综合征(D-IBS)与精神因素，胃肠激素分泌紊乱，炎症介质及免疫因子促发等因素有关〔2〕，现代医学对此病尚无完全有效治疗药物。祖国传统医学认为D-IBS与中医脾虚证或脾虚为主证的脏腑病证密切相关〔3，4〕，临床多应用以益气健脾止泻或温中健脾止泻类中药复方为主进行干预，疗效显著。本研究探讨四君子汤和理中汤对D-IBS大鼠血清及小肠组织一氧化氮信号通路(NO/NOS)及胃动素(MOT)表达差异的影响。

1 实验材料

1.1动物 采用SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，3月龄，体重(180±20)g，由甘肃中医学院医学实验中心提供(动物合格证号SCXK〔甘〕2011-0001-0001011；实验设施合格证SYXK〔甘〕2011-0001-0000315)。

1.2药物与试剂

1.2.1四君子汤 以人参、白术、茯苓、甘草原药材按3∶3∶3∶2比例配制并加工，第1次加10倍量蒸馏水浸泡4 h。按常法煎煮2次，每次40 min，滤出药液置70℃～80℃水浴浓缩至每1 ml药液含生药2 g，冷却后4℃冰箱备用，用时配至所需浓度。

1.2.2理中汤 以人参、白术、干姜、甘草原药材按1∶1∶1∶1比例配制并加工，第1次加10倍量蒸馏水浸泡4 h。按常法煎煮2次，每次40 min，滤出药液置70℃～80 ℃水浴浓缩至每1 ml药液含生药2 g，冷却后置4℃冰箱备用，用时配至所需浓度。

1.2.3番泻叶制剂 将番泻叶粉碎成粉，用蒸馏水浸泡，置于50℃水浴6 h浓缩为含量1 g/ml药剂，去渣取汁4℃保存,使用时稀释至所需浓度。以上中药原药材均购自兰州复兴厚中药材有限责任公司，并经甘肃中医学院药学系中药生药学教研室杨扶德教授鉴定合格。

1.3试剂盒 考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，批号20110925；一氧化氮(NO)试剂盒，批号20110923；一氧化氮合酶(NOS)试剂盒，批号20110926(南京建成医学生物研究所)；胃动素(motilin，MOT)放免试剂盒(北京华英生物技术研究所，批号20111010)。

1.4主要仪器 DF110型电子分析天平(常熟衡器工业公司，江苏省常熟市)；721型可见光分光光度计(北京瑞利分析仪器制造公司，北京)；XYJ80-2离心机(江苏省金坛市恒丰仪器制造有限公司，江苏省金坛市)；HH-4数显恒温水浴箱(常州国华电器有限公司，江苏省常州市)；FT-630G微机多探头r计数器(科大创新股份有限公司中佳分公司，安徽省合肥市)；KDC-2044低速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司，安徽省合肥市)。

1.5实验方法

1.5.1分组与造模 适应性饲养6 d后，受试动物按体重编号，用随机数字表法〔5〕分为空白组(n=10)和造模组(n=60)。除空白组外，造模组大鼠参照文献〔6〕造模：以番泻叶煎剂溶液(0.4 g/ml)按10 ml/kg剂量灌胃，1次/d；在灌服完番泻叶煎剂1 h后,即用粗制棉绳束缚大鼠的两后肢，使之行动不便，躁动不安，造成一定应激刺激，持续2 h，1次/d，以上两法复合连续造模时间持续14 d。造模结束后筛选符合D-IBS模型大鼠，并采用随机法分为D-IBS模型组、四君子汤组、理中汤组，每组10只，雌雄各半分笼饲养。

1.5.2给药方法 造模14 d结束后，四君子汤组给予20 g·kg-1·d-1四君子汤药剂灌胃，理中汤组给予20 g·kg-1·d-1理中汤药剂灌胃，等效剂量按照实验动物研究“等效剂量”计算方法(按60 kg成人体表面积换算标准剂量2倍量)折算，灌胃容积为10 ml/kg体重，连续灌胃给药14 d，空白组、IBS模型组给予同体积蒸馏水灌胃；各组均以蒸馏水、标准饲料喂养。

1.5.3胃排空实验 参照文献〔7〕：从第14天晚上8时开始禁食、不禁水至第16天早晨8时，共禁食36 h。给半固体营养糊2 ml，30 min后用10%水合氯醛麻醉后股动脉采血，制备待检标本。随后迅速打开腹腔，结扎幽门和贲门后取出胃，清除胃表面的血渍，第1次称重(胃总重)，后剪开胃体，洗去胃内容物，用滤纸吸干水分第2次称重(胃净重)，按公式计算：胃残留率=(胃总重-胃净重)/2×100%。

1.5.4小肠推进实验 参照文献〔8〕：结扎幽门和回盲部，分离肠系膜，测量幽门至回盲部的长度作为小肠总长度，从幽门至营养糊黑染的距离作为小肠推进长度。按公式计算：小肠推进率=营养糊推进距离(cm)/小肠全长(cm)×100%。

1.5.5标本采集与效应指标检测

1.5.5.1血清胃动素(MOT)测定 将股动脉取得的3 ml，静置2 h后离心(2 000 r/min)10 min，取上清，放入尖底管中4℃低温冰箱保存待测效应指标。

1.5.5.2小肠组织的收集 大鼠处死后，迅速将近胃窦端小肠组织截取，称重后分别用眼科小剪刀快速剪碎，分别置于匀浆器中，用组织重9倍生理盐水匀浆(匀浆器的末端置于放冰块的冷水中)，并以3 500 r/min 离心10 min，取上清液置4℃冰箱保存，采用化学比色法检测NO/NOS，放免法检测MOT。

2 结 果

2.1各组大鼠一般生存情况 空白组大鼠始终表现为反应灵敏，活动及饮食量正常，被毛浓密柔顺而有光泽，粪便呈棕褐色颗粒状。D-IBS模型组大鼠多数在第4天即开始出现倦卧、被毛稀疏干枯；第7天后出现怠动少食、消瘦拱背，肛周污秽，部分动物出现脱肛，甚至动作迟缓，同时毛发失去光泽而枯槁、疏散，成群蜷缩或拱背，并逐渐出现体重减轻，大便增多(垫料呈橘黄色)等“脾虚”症状(D-IBS模型组1只大鼠因灌胃操作不当致死，尸检未见明显异常)。四君子汤、理中汤组大鼠第6天出现轻度倦卧、被毛稀疏干枯；第9天后出现少食、怠动、消瘦，肛周污秽，少部分动物出现脱肛，动作迟缓，大便增多等，第12天后上述症状开始减轻或消失，表现为反应较为灵敏，活动及饮食量正常，被毛疏散但有光泽，粪便呈颗粒状。

2.2各组大鼠胃残留率和小肠推进率的比较 与空白组比较，模型组大鼠胃残留率明显升高，小肠推进率显著升高(P<0.01)；与模型组比较，四君子汤和理中汤均能降低胃残留率和小肠推进率，但以理中汤作用显著(P<0.05，P<0.01)，且在抑制小肠推进率方面，理中汤组较四君子汤显著(P<0.05)。见表1。

2.3各组大鼠血清及小肠组织NO/NOS表达差异的比较 见表2。与空白组比较，模型组大鼠血清及小肠组织NO、NOS计数水平有下降趋势(P<0.01，P<0.05)；经中药干预后并与模型组比较，四君子汤和理中汤均能升高血清及小肠组织NO、NOS水平，(P<0.05)，且在调节小肠组织NO、NOS方面，理中汤组与四君子汤比较以理中汤作用显著(P<0.05)。

表1 各组大鼠胃残留率和小肠推进率的比较±s，%)

表2 各组大鼠血清及小肠组织NO/NOS表达差异的比较±s)

2.4各组大鼠血清及小肠组织MOT表达差异的比较 与空白组比较，模型组大鼠血清及小肠组织MOT水平均显著升高(P<0.01)；经中药干预后，四君子汤和理中汤均能降低血清及小肠组织MOT水平(P<0.05，P<0.01)，且在调节小肠组织MOT水平方面，四君子汤和理中汤组比较，以理中汤作用显著(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清及小肠组织MOT表达差异的比较±s)

3 讨 论

IBS是一种临床最常见的慢性肠功能紊乱疾病，由于该病缺乏可解释症状的形态学改变和生化异常，临床表现复杂，常以结肠症状为主，也可表现为消化道其他症状甚至躯体症状。目前IBS的病因尚未完全明了，但涉及因素较多，与肠道运动异常、内脏感觉异常、脑肠相互作用、神经免疫机制紊乱等有关。其中肠神经系统(ENS)是胃肠壁内的自主神经系统，具有独立于大脑而行使其功能的完整结构。研究表明〔7，8〕NOS广泛分布于胃肠道，其产物NO是非肾上腺素能非胆碱能神经的抑制性递质，广泛参与胃肠生理功能。NO不仅在神经传导、胃肠保护、内分泌调节和宿主防御机制中起重要作用，而且参与多种病理发生的信号转导〔9〕。生理性的NO对胃动力的影响是一个抑制性过程，具有延缓胃排空功能，而NO分泌不足或过量均可导致胃肠黏膜受损和运动紊乱。已有研究〔10〕发现胃平滑肌细胞和胃肌间神经丛含有大量的NOS，说明了NO在调节胃动力中的重要性。

如 Sjolund等〔11，12〕学者研究表明,IBS的胃结肠反射(进食可以刺激结肠运动，引起结肠收缩增加，从而激发便意，称为胃结肠反射)多由胃肠激素浓度的变化调节，而且胃肠激素对胃肠道的分泌、运动、吸收、营养和免疫等起着重要作用,它们的分泌异常可导致胃肠道运动紊乱。MOT作为胃肠激素之一，是由22个氨基酸组成的多肽，全部小肠均有分布，其主要作用是促进和影响胃肠运动及胃肠道对水、电解质的运输。MOT可通过激发消化间期肌电活动Ⅲ相、促进胃强力收缩和小肠分节运动，该运动呈周期性出现并向小肠远端传播，故MOT有促进结肠运动的作用〔13〕。临床研究表明〔14〕IBS患者血浆MOT水平过高时，肠道蠕动加速，临床表现为腹痛、腹泻等症状。

中医学基于D-IBS持续存在或间歇发作的“腹泻、腹痛或食入即泻”等临床症状群特征，将其归纳为“泄泻、腹痛”等范畴，认为本病病因在于外邪直中、饮食不节、劳倦体虚等，导致脾胃虚弱，升降失调，或脾虚湿盛，下注大肠，虽病位在肠，但其本在脾，故证候类型多归纳为脾虚证或脾虚湿盛证，亦有大量研究表明脾虚证都存在肠神经系统分泌异常、胃肠道运动和小肠分泌吸收功能紊乱〔15〕，由此提示IBS发生与中医脾虚证的病机实质关系密切，而且在中医临床上诸多医家常常应用益气健脾的四君子汤或温中健脾的理中汤加减治疗脾虚腹泻之症。经方四君子汤以人参、白术、茯苓、炙甘草四味药物配伍组成共凑益气健脾之功，而理中汤以人参、白术、干姜、炙甘草配伍组成共凑温中健脾之功，两首复方虽均能治疗脾虚腹泻之证，但理中汤配方中以干姜替代茯苓，加强了温中散寒，回阳燥湿的功效。

本研究结果提示D-IBS大鼠存在胃肠排空、转运功能紊乱，NO信号通路关键分子和胃肠激素分泌紊乱；D-IBS大鼠经中药干预后并与模型组比较，四君子汤和理中汤均能降低胃残留率和小肠推进率，升高血清及小肠组织NO、NOS水平，降低血清及小肠组织MOT水平，说明四君子汤和理中汤调节D-IBS大鼠小肠NO、NOS、MOT作用相似，且理中汤在调节小肠组织NO、NOS、MOT表达水平方面的作用优于四君子汤，提示理中汤较四君子汤去茯苓加用干姜后，加强了温中散寒，燥湿止泻之功，说明恢复中土脾之阳气是中医药治疗脾虚腹泻型IBS的作用途径之一，但四君子汤和理中汤干预IBS的其他作用机制差别还需要深入研究。

4 参考文献

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