内皮素-1基因多态性与海南汉族人原发性高血压的相关性

王 镇 张 勇 吴 恳 金水晶 苏 娅 周代峰 邱逸敏 黄 玲 晏辉芳

(海南省干部疗养院，海南 海口 571100)

原发性高血压(essentialhypertension, EH)是遗传与环境因素的交互作用的结果，是心脑血管疾病发生的独立危险因素。内皮素-1(ET-1)是由血管内皮细胞分泌的血管收缩肽，也是迄今所致人体内最强烈的血管收缩剂，参与许多疾病的发生发展过程。近些年研究发现该基因与高血压的发生密切相关。基因多态性是形成个体差异的遗传基础，也是很多疾病发生的遗传基础。获得ET-1基因多态性与原发性高血压的关联性，对原发性高血压的防治具有重要意义。本研究拟探讨ET-1基因的三个多态性位点ET-1+138A/-、 K198N、G8002A与海南汉族EH的相关性。

1 对象和方法

1.1对象 EH组：随机选取2010～2013年于海南省老年病医院住院的海南籍汉族无血缘关系的EH病人201例，诊断符合1999年世界卫生组织(WHO)与国际高血压学会(ISH)和2004年中国高血压防治指南标准，即收缩压≥140 mmHg和(或)舒张压≥90 mmHg。所有入选者排除继发性高血压、冠心病、糖尿病、肿瘤及严重肝肾功能损害。正常对照组：随机选取海南籍汉族健康居民311例，无血缘关系和高血压家族史，排除冠心病、糖尿病、肿瘤、肝肾功损害者。

1.2方法

1.2.1引物的设计与合成 从GenBank中获得人类ET-1基因的DNA全序列和mRNA序列, 用PRIMER6.0 软件辅助设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。见表1。

1.2.2基因多态性检测 ①PCR扩增：每个多态位点均设立2个PCR检测管, 分别加入寡核苷酸正常和突变引物用于检测每个多态位点正常和突变的等位基因。反应总体积为20 μl，反应体系：1×PCR缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2)中含模板DNA 0.2 μg,引物各0.1～0.15 μmol/L，4种dNTP各200 μmol/L, Taq DNA聚合酶(康为世纪)1 U。加入1滴石蜡油覆盖。反应时，先加入3 μl模板 DNA 溶液，再加入上述混合体系17 μl，最后加入1滴石蜡油覆盖，接着在PCR仪中进行扩增。PCR循环参数：K198N位点和G8002位点：首先94℃进行2 min热变性，随后进行35个循环反应(94℃30 s，56℃30 s，72℃50 s)，后72℃延伸10 min。+138A/-位点：首先94℃进行2 min热变性，随后进行36个循环反应(94℃30 s，55℃30 s，72℃50 s)，后72℃延伸10 min。4℃保存。②序列测定：随机抽取上述送上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA 序列测定。③基因分型：每种ET-1基因突变位点都利用突变型引物和野生型引物同时进行两管PCR扩增，根据每个样品两种等位基因扩增产物结果，可准确判定样品的基因类型。

表1 等位基因特异性PCR的引物序列及扩增片段长度

1.3统计学方法 基因频率采用基因计数法计算。研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度用χ2检验。组间基因型与等位基因频率比较用χ2检验。采用SPSS16.0软件。

2 结 果

2.1三种ET-1基因多态位点的基因分型结果 见图1。K198N位点检测出198GG、198GT和198TT三种基因型,G8002A位点检测出了8002GG、8002GA和8002AA三种基因型,+138A/-位点检测出了138(4A4A)、138(4A3A)和138(3A3A)三种基因型。测序结果表明等位基因特异性PCR技术对ET-1基因+138A/-位点、K198N位点、G8002A位点和T8000C位点基因突变的分型结果与DNA测序结果相符，说明基因分型结果的特异性和准确率均较高。

M:100 bp DNA Ladder; 1、2, 3、4, 5、6 分别为+138A/-突变位点138(4A4A)、138(4A3A)、138(3A3A) 基因型样本正常引物和突变引物的扩增结果，7、8, 9、10,11、12分别为K198N 突变位点198GG、198GT、198TT 基因型样本正常引物和突变引物的扩增结果; 13、14、15、16、17、18分别为G8002A突变位点8002GG、8002GA、8002AA基因型样本正常引物和突变引物的扩增结果。

2.2ET-1基因+138A/-、K198N、G8002A多态性与海南汉族EH的相关性 见表2、表3。两组群体经χ2检验,均符合Hardy-Weinberg平衡,说明该群体具有代表性。海南汉族原发性高血压患者中，ET-1基因 +138A/-、 K198N位点基因型频率与对照组比较有明显差异。+138A/-、 K198N、G8002A 3个多态位点上的等位基因3A(+138A/-)、G(K198N)、G(G8002A)在高血压患者组中分布频率明显高于对照组(P<0.05)。

表2 海南地区汉族正常人群和EH患者ET-1基因三种多态位点等位基因的频率分布〔n(%)〕

表3 海南地区汉族正常人群和EH患者ET-1基因三个多态位点基因型的频率分布〔n(%)〕

3 讨 论

内皮细胞生成的舒张因子和收缩因子的拮抗性平衡是影响血压以及血管张力的关键〔1〕。一氧化氮、ET及血管紧张素II三者在血压调节中起重要作用，若三者失去平衡，则可导致高血压发病〔2〕。ET-1是内皮细胞合成的最强的血管收缩因子之一，在原发性高血压中，该蛋白在血浆中的水平与高血压的程度成正相关，且随着靶器官损害程度而加重〔3，4〕。这充分说明ET在原发性高血压的发生及发展过程中起着十分重要的作用。康建华等〔5〕研究发现血浆ET-1浓度可作为判断高血压患者病情的指标，除此之外，ET-1活性也是高血压的危险因素。

ET-1的浓度及活性主要取决于其基因的变化，即突变。单核苷酸多态性(SNP)是基因突变的一种形式，也是形成人类个体差异的遗传基础，研究ET-1基因SNP位点多态性与原发性高血压的关联，可能为原发性高血压的诊断、预测及干预提供参考依据。ET-1的编码基因EDN1位于6p23一p24，目前已经发现该基因存在多态多态位点，例如转录起始部位1370TG，外显子1的+138A-，内含子1的+1932G/A，第198个密码子K198N，第4外显子的8000T/G等。本研究选取+138A/-、 K198N、G8002A 3个多态性位点作为研究对象。

K198N(Lys198Asn)是ET-1基因第158号密码子中的G突变为T而导致了赖氨酸与天冬氨酸的转换，是目前文献中报道较多的多态位点〔6～8〕。ECTIM等在对欧洲人群的研究中发现该位点多态性与血压水平相关，基因型TT患者的血压高于其他基因型。本研究结果提示GG可能与海南人群原发性高血压存在密切关联。

+138A/-是位于5′-未翻译区起始部位下游138 bp的一个插入缺失型变异位点.研究发现高血压组与对照组有明显差异性说明+138A/-的基因多态性与高血压明显相关。海南籍汉族高血压患者中， 3A型携带者血压更容易升高，3A型等位基因可能是血压升高的一个危险因素。

4 参考文献

1Yanggisawa M，Kurihara H，Kimura S，etal.A novel potent vasoconsiction peptide produced by vascular endothelia cells〔J〕.Nature，1998；332(6163):411-5.

2任军生，姚加平.原发性高血压患者治疗前后血浆ET-1和血清NO、CGRP检测的临床意义.放射免疫学杂志,2013;26(4)：403-4.

3Barton M.Reversal of proteinuric renal disease and the emerging role of endothelin〔J〕.Nat Clin Pract Nephrol,2008;4(9):490-501.

4Krum H,Viskoper RJ,Lacourciere Y,etal.The effect of an endothelin-receptor antagonist, bosentan, on blood pressure in patients with essential hypertension〔J〕.N Engl J Med, 1998;338(12):784-90.

5康建华，赵连友，张跃义.高血压病患者血浆内皮素的改变及其临床意义.中国心血管病杂志,2003(1-6)：209-10.

6Black HR, Bakris GL, Weber MA,etal.Efficacy and safety of darusetan in patients with resistant hypertension: results from a randomized, double-blind, placebo-controlled dose-ranging study〔J〕.J Clin Hypertens(Greenwich), 2007;9(10):760-9.

7Tiret L,Poirier O,Hallet V,etal.The Lysl98Asn polymorphism in the endothelin-1 gene is associated with blood pressure in over weight people〔J〕.Hypertension,1999;33:1169-74.

8Barden AE，Herbison CE,Beilin LJ，etal.Association between the endothelin-1 gene Lys198 Asn polymorphism blood pressure and plasma endothelin-1 levels in normal and pre-eclamptic pregnancy〔J〕.J Hypert，2001;19(10):1775-82.