缺血修饰性白蛋白指数结合FTIR技术评估早期糖尿病肾病的氧化应激损伤

1 对象与方法

1.1对象收集我院2012年1月至2013年3月入院治疗的2型糖尿病(T2DM)患者106例(诊断标准参照WHO/IDF《糖尿病及其引起的高血糖的定义和诊断》2006年版)〔1〕，根据24 h尿微量白蛋白排泄率(UMAER)将患者分为SDM组49例(UMAER<20 μg/min)、EDN组57例(20 μg/min≤UMAER≤200 μg/min)，健康志愿者(对照组)32例(经体检确定)，所有受试者排除冠心病、缺血性动脉疾病、高血压、肝脏疾病、血清白蛋白水平异常(<3.5 g/dl或>5.5 g/dl)、原发性肾病及血液透析。 SDM组、EDN组与对照组年龄、性别基本匹配。SDM组与EDN组年限差异无统计学意义(P>0.05)。EDN组的收缩压高于对照组，而舒张压与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)；EDN组与SDM、SDM组与对照组比较，收缩压及舒张压差异均无统计学意义(P>0.05)。SDM组、EDN组的WHR均显著高于对照组，但糖尿病两个亚组之间比较差异无统计学意义。见表1。

1.2基本情况采集受试者的年龄、性别、患DM年限、收缩压、舒张压、腰围(W，肋骨下缘与髂嵴连线中点水平周径)、臀围(H，臀部最大周径)等基本信息，计算局部体脂，以腰臀比(WHR)报告。

表1 各组资料对比情况±s)

1.3生化指标应用全自动生化分析仪(Roche，瑞士)及原装配套试剂检测血清肌酐、空腹血糖、糖化血红蛋白、肌酸激酶(CK)同工酶(CK-MB)及血清白蛋白。应用自动免疫比浊法检测尿微量白蛋白。应用ELISA试剂盒(Cell Biolabs，美国)检测血8-羟化脱氧乌苷(8-OHdG)水平。应用白蛋白-钴结合(ACB)试验相关试剂(Ischemia Technology)检测IMA〔2〕。

1.4ATR-FTIR检测及光谱分析应用Nicolet iN10傅里叶变换红外光谱仪(Thermo Fisher，美国)，MCT检测器，iZ10 micro-ATR附件及匹配OMNIC 8.0软件包。参数选择透射模式，分辨率为4/cm，扫描次数为64次，以去离子水为扫描背景。应用OMNIC读取光谱，进行自动基线校正、自动平滑、ATR校正，ZnSe晶体，底角45°。读取1 650/cm及1 550/cm附近吸收峰的峰面积，以A1 650/A1 550报告。

2 结果

2.1生化指标本研究检测的血清肌酐、CK-MB及血清白蛋白仅用于样本筛选，不进行统计学分析。SDM组及EDN组的空腹血糖分别为(7.21±1.31)、(7.96±1.15)mmol/L，差异无统计学意义；两组的糖化血红蛋白分别为(7.4±1.1)%、(7.5±1.2)%，差异无统计学意义；对照组、SDM组及EDN组的8-OHdG分别为13.0±3.9、21.2+5.0、29.4±7.5，SDM组与对照组、EDN组比较差异有统计学意义(P<0.05)，对照组与EDN组比较差异有统计学意义(P<0.01)；对照组、SDM组及EDN组的IMA指数分别为78.1±9.8、96.7±11.1、108.8±9.8，其中SDM组及EDN组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，SDM组与EDN组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2红外光谱对照组、SDM组及EDN组平均红外光谱显示范围为1 710～1 480/cm。对照组、SDM组及EDN组的A1 650/A1 550对比，其中SDM组与对照组、EDN组比较差异显著(P<0.05)，对照组与EDN组比较差异显著(P<0.01)。

3 讨论

DN是DM全身性微血管病变表现之一，临床特征为蛋白尿、渐进性肾脏损害、高血压、水肿，晚期可出现严重肾衰。英国远期DM研究组指出严格控制血糖可以降低T2DM患者合并DN的风险〔3〕，但我国DM患者的血糖控制普遍不理想，T2DM患者合并DN的患病率高达38.8%〔4〕。高血糖引起肾脏血流动力学变化以及葡萄糖代谢异常引起的级联损伤是造成肾脏病变的基础，而生长因子、细胞因子的活化是DN形成的直接机制，在上述诸多发病机制中，目前认为氧化应激是重要的共同机制〔5〕。因此，有效地对DM患者进行氧化应激评估，不仅有利于EDN的及时诊断，而且有利于系统评价患者的氧化应激损伤或提供治疗的新靶点。

ROS产物水平是评估氧化应激的常用指标，考虑到蛋白质广泛存在于细胞内外，极易受ROS攻击发生氧化修饰或出现蛋白羰基，在氧化应激早期即可形成，且具有较好的稳定性，因此可通过测定相关生物标志物作为氧化应激评估，例如IMA。Roy等〔6〕认为IMA升高可以有效反映机体氧化应激水平，Lee等〔2〕证实IMA指数可以有效校正个体蛋白差异对检测的影响。本实验结果从一定程度上印证了DM患者合并肾病的根本机制是由于机体的氧化应激损伤，该指标对于诊断EDN意义重大。

根据Moganson分类，认为出现微量蛋白尿是诊断DN的标准，但近年来UMEA的出现是否代表肾脏损害、是否必然出现DN进展屡现争议。由于UMEA并不能完全作为诊断DN的指标，大量研究寻找其他可以预测或评估肾脏损害的临床及实验室指标。p16蛋白(一种皮肤成纤维细胞中与细胞周期调节相关的调节蛋白)虽然可以用于预测DN发生，但方法过于繁琐，难以推广〔7〕。因此，寻找检测便捷、行之有效的生物指标，对于EDN的诊断尤为重要。傅里叶变换红外光谱技术的发展始于上世纪80年代，该技术具有快速、准确、无损地对生物样本进行分子水平测定的特点。结合ATR附件后，可以有效纠正、消除水对于光谱的影响，更适用于血清等液体样本的检测。ATR-FTIR可以系统地分析脂质、核酸以及蛋白质的结构及含量，而且可以有效地分析蛋白质二级结构，从而评估组织或细胞的氧化应激水平〔8〕。本研究结果显示A1 650/A1 550，可以有效地反映SDM患者及EDN患者机体不同的氧化应激水平，同时该方法兼具检测便捷的优点，单个样本扫描时间仅为数十秒，且无需对样本进行处理。

4 参考文献

1World Health Organization. Definition and diagnosis of diabetes mellitus and intermediate hyperglycaemia-report of a WHO/IDF consultation〔M〕. Geneva：WHO Press,2006：13-6.

2Lee YW，Kim HJ，Cho YH，etal. Application of albumin-adjusted ischemia modified albumin index as an early screening marker for acute coronary syndrome〔J〕. Clin Chim Acta， 2007；384(1-2)：24-7.

3UK Prospective Diabetes Study Group. Intensive blood-glucose control with sulphonylureas or insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patients with type 2 diabetes(UKPDS 33)〔J〕. Lancet，1998；352(9131)：837-53.

4Kung k，Chow KM，Hui EM，etal. Prevalence of complications among Chinese diabetic patients in urban primary care clinics：a cross-sectional study〔J〕. BMC Fam Pract，2014；15(1)：8.

5Tavafi M. Diabetic nephropathy and antioxidants〔J〕. J Nephropathol，2013；2(1)：20-7.

6Roy D，Kaski JC. Ischemia-modified albumin：the importance of oxidative stress〔J〕. J Am Coll Cardiol,2007；49(24)：2375-6.

7Zeng L，Kanwar YS，Amro N，etal. Epigenetic and genetic analysis of p16 in dermal fibroblasts from type 1 diabetic patients with nephropathy〔J〕. Kidney Int，2003；63(6)：2094-102.

8Palaniappan PR，Vijayasundaram V. Fourier transform infrared study of protein secondary structural changes in the muscle of Labeo rohita due to arsenic in toxication〔J〕. Food Chem Toxicol，2008；46(11)：3534-9.