胰岛素生长因子结合蛋白-2 siRNA表达载体的构建及鉴定

许淑芬 王英凯 刘 磊 孙牧男 马寅芙 方艳秋 谭 岩

(吉林省人民医院中心实验室，吉林 长春 130021)

胰岛素生长因子结合蛋白(IGFBP)-2与大脑发育有关〔1〕。脑中IGFBP-2在一些急、慢性非生理状态下会升高，如外伤、缺氧、细胞再生等，升高的IGFBP-2来源于活化的星形细胞及微胶质细胞。Sallinen等〔2〕发现，高度恶性的胶质母细胞瘤(GBM)中IGFBP-2高表达，其表达越高，愈后越差。Elmlinger等〔3〕发现,大量表达IGFBP-2的细胞常聚集于肿瘤坏死灶附近。Muller等〔4〕发现,中枢神经系统肿瘤病人脑脊液IGFBP-2显著升高。提示IGFBP-2可能作为胶质瘤的诊断指标和治疗靶点。RNA干扰(RNAi)是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重要生物学和临床意义。本研究拟构建针对IGFBP-2的siRNA表达载体，通过RNAi技术实现IGFBP-2基因沉默，为脑胶瘤基因治疗提供物质基础。

1 材料与方法

1.1主要材料 胶质瘤U251细胞株、大肠杆菌DH5α、pSilencer 2.1-U6 neo载体本室保存； Trizol Reagent、LipofectamineTM2000转染试剂盒为Invitrogen公司产品；AMV Reverse transcriptase为Promega公司产品；Taq DNA polymerase、T4 DNA ligase、限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ均为Takara公司产品, 胎牛血清为Hyclone公司产品；单克隆抗体及二抗购自北京晶美公司；引物由赛百盛公司合成。

1.2IGFBP-2 siRNA、IGFBP-2、β-actin引物的设计与合成 根据GenBank中报道的IGFBP-2核苷酸序列(NM-000597)，参考siRNA及引物的设计原则，利用Ambion公司siRNA在线设计软件，从IGFBP-2核苷酸序列起始密码子下游寻找符合设计特征的靶序列，筛选得到576～594 nt、908～926 nt、938～956 nt 3个19 bp片段为靶序列，设计的siRNA序列5'端和3'端分别引入BamHⅠ、HindⅢ两个酶切位点，加入9 bp的loop环结构，3'末端加转录终止信号TTTTTT。采用国际通用的与所有基因均无同源性的序列siRNA为阴性对照，见表1。经BlastSearch检索确认与IGFBP-2以外的人类已知基因序列无同源性。

1.3寡核苷酸退火 将合成的IGFBP-2及阴性对照siRNA寡核苷酸分别溶解在50 μl无核酸酶的水中，后各取2 μl加入6 μl 10×退火缓冲液。90℃孵育3 min，缓慢降温，37℃孵育1 h，然后缓慢冷却至4℃；2%琼脂糖电泳。

1.4重组表达载体的构建及鉴定 pSilencer 2.1-U6经BamHⅠ和HindⅢ双酶切线性化。取2 μl上述各组退火产物， 1 μl双酶切后线性化的pSilencer 2.1-U6载体，1 μl 10×T4连接酶缓冲液、1 μl T4 DNA连接酶，5 μl无核酸酶去离子水，建立连接反应，16℃过夜连接。次日分别转入大肠杆菌DH5α感受态细菌，转化菌落接种于含氨苄青霉素LB培养板中，37℃过夜。提取质粒，酶切、测序鉴定,筛选出阳性克隆。

1.5重组表达载体的转染及筛选 取对数生长期的U251细胞接种于6孔板，密度达80%时，用IipofectaminTM2000转染重组质粒，转染6 h以后更换含20%FBS培养液继续培养48 h。G418筛选，收集G418抗性细胞。

1.6RT-PCR检测IGFBP-2 mRNA的表达 参照Invitrogen公司说明，使用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，使用逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA，选择β-actin作为内参照。PCR循环参数：95℃预变性5 min，然后95℃45 s、55℃45 s、72℃45 s，30个循环后再72℃延伸10 min。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描电泳结果。

1.7Western印迹分析IGFBP-2 蛋白的表达 收集各组细胞，加入细胞裂解液，蛋白变性，测定蛋白的含量。取适量样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；用半干式转移电泳仪电转硝酸纤维素膜3 h , 3 %BSA 封闭液4℃过夜, 1×PBS 洗膜,加入鼠抗人IGFBP-2 单抗(1∶500) , 37℃结合2 h , 洗膜, 加入马抗小鼠IgG (1∶500) , 37℃结合2 h , 洗膜, 充分洗涤显色，化学发光仪检测PVDF膜上IGFBP-2蛋白的表达。

表1 针对IGFBP-2基因设计的寡核苷酸序列

2 结 果

2.1重组载体测序及酶切鉴定 重组载体测序结果证实IGFBP-2 siRNA成功构建于pSilencer 2.1-U6载体上，与目的序列相同。将重组质粒pSilencer 2.1-IGFBP-1、pSilencer 2.1-IGFBP-2、pSilencer 2.1-IGFBP-3、pSilencer 2.1-IGFBP-NC经BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切产生约65 bp 大小的目的片段。见图1。

2.2RT-PCR检测IGFBP-2 mRNA的表达 转染pSilencer 2.1-IGFBP-1(0.229±0.018 1)、pSilencer 2.1-IGFBP-2(0.008±0.005 1)、pSilencer 2.1-IGFBP-3(0.173±0.035 1)的U251胶质瘤细胞与3个对照组相比IGFBP-2 mRNA表达明显降低(P<0.01)，且pSilencer 2.1-IGFBP-2的沉默抑制作用强于pSilencer 2.1-IGFBP-1和pSilencer 2.1-IGFBP-3，几乎完全抑制，差异有统计学意义(P<0.01)。而3个对照组〔(无关siRNA对照组(0.476±0.044 2)、空载体对照组(0.494±0.065 2)和U251细胞对照组(0.418±0.045 2)〕细胞中都存在较高水平的IGFBP-2 mRNA表达。见图2。

M:DNA 标准 DL2000+15000;1:无关 siRNA 退火产物;2:pSilencer 2.1-IGFBP-1双酶切;3:pSilencer 2.1-IGFBP-2双酶切;4:pSilencer 2.1-IGFBP-3双酶切;5:pSilencer 2.1-IGFBP-3双酶切

M:DNA 标准 DL2000+15000;1:U251细胞； 2:转染 pSilencer 2.1-IGFBP-NC； 3:转染pSilencer 2.1-U6； 4:转染pSilencer 2.1-IGFBP-1； 5:转染pSilencer 2.1-IGFBP-2;6:转染pSilencer 2.1-IGFBP-3

1:U251细胞； 2:转染 pSilencer 2.1-IGFBP-NC； 3:转染pSilencer 2.1-U6； 4:转染pSilencer 2.1-IGFBP-1； 5:转染pSilencer 2.1-IGFBP-2;6:转染pSilencer 2.1-IGFBP-3

2.3Western印迹分析IGFBP-2 蛋白的表达 图3可见，转染实验组细胞与3个对照组相比IGFBP-2蛋白表达明显降低，且pSilencer 2.1-IGFBP-2的沉默抑制作用强于pSilencer 2.1-IGFBP-1、pSilencer 2.1-IGFBP-3，而3个对照组(无关siRNA对照组、空载体对照组和U251细胞对照组)细胞中都有较高水平的IGFBP-2蛋白表达。

3 讨 论

IGFBP-2属于胰岛素样生长因子家族，可通过IGF依赖和非依赖性作用发挥其生物学功能，与胶质瘤的发生发展关系密切，具有调节细胞增生、促血管生成、促细胞迁移和促肿瘤侵袭性作用〔5～8〕。用基因表达微阵列技术发现在人类进展期神经胶质瘤及成胶质细胞瘤中，IGFBP-2基因表达异常升高，进一步的研究提示，IFBP-2基因高表达将有利于肿瘤的侵袭〔9〕。有作者发现，IGFBP-2在神经胶质瘤SNB19细胞中的过度表达能增强肿瘤细胞的侵袭潜能，且造成肿瘤发展的部分原因是由于IGFBP-2的过度表达导致MMP-2的表达增加，促进了肿瘤的侵袭〔7〕。许多文献证明 中枢神经系统恶性肿瘤血浆、组织ICFBP-2水平明显上调〔10，11〕，且随着IGFBP-2水平增高愈后不良〔12，13〕。因此提示IGFBP-2可能作为胶质瘤的治疗靶点，通过降低IGFBP-2水平抑制胶质瘤细胞的生长，促进其凋亡。

RNAi现象的特点：高度特异性，高沉默效率，高穿透性，只有针对编码区的dsRNA序列才能产生有效特异性干扰，对内含子和启动子则不能产生〔5，6〕。目前制备siRNA的方法主要是体外合成和体内表达。体外化学合成方法价格昂贵，抑制效果维持时间短。体外转录合成siRNA以DNA寡核苷酸为模板，在体外转录合成,优点是经济实惠，但是反应规模受到限制，适合于筛选。使用质粒DNA构建的siRNA表达载体可在细胞内长时间、稳定地生成小干扰RNA，使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能〔14〕。本研究使用的pSilencer 2.1-U6 neo带U6启动子和一个有6个T的转录终止位点。将编码IGFBP-2基因的特异序列(其RNA能形成发夹状结构)插人载体U6启动子的下游，转入胶质瘤U251细胞内，载体从一个保守的A开始转录合成RNA，遇到连续的T即在转录终止位点的第2个碱基处终止转录，从而表达出shRNA，shRNA很快在细胞中被加工成为siRNA，随后启动RNAi过程。采用这种方法的优点在于合成siRNA的过程转移至细胞内进行，排除了RNA酶的干扰，延长了siRNA的半衰期；同时由于载体可以复制和扩增，所以能够显著降低siRNA的成本；另外，利用该方法可以进行稳定表达细胞株的筛选。随着载体质粒的复制扩增，RNAi可以扩散到整个机体，基因抑制效果可以传代。本研究设计了能够在细胞内表达针对IGFBP-2基因的shRNA的质粒并将其导人U251细胞。实验结果表明，RNAi质粒载体的导入明显抑制了IGFBP-2 mRNA以及蛋白的表达。空质粒组与空白对照组的结果差异无显著性，排除了质粒本身对基因的抑制作用。阴性对照组与空白对照组的结果差异亦无显著性，说明了RNAi的高度特异性。本实验成功构建了靶向IGFBP-2基因的siRNA载体，并能有效抑制U251细胞中IGFBP-2 mRNA和蛋白的表达，其中以pSilencer-IGFBP-siRNA2的沉默效果最强，为进一步研究利用RNAi技术抑制脑胶质瘤奠定了基础。

4 参考文献

1Russo VC，Gluckman PD，Feldman EL，etal.The insulin-like growth factor system and its pleiotropic functions in brain〔J〕.Endocr Rev，2005;26(7)：916-43.

2Sallinen SL，Sallinen PK，Haapasalo HK，etal.Identification of differentially expressed genes in human gliomas by DNA microarray and tissue chip techniques〔J〕.Cancer Res，2000;60(23)：6617-22.

3Elmlinger MW，Deininger MH，Schuett BS，etal.In vivo expression of insulin-like growth factor-binding protein-2 in human gliomas increases with the tumor grade 〔J〕.Endocrinology，2001;142(4)：1652-8.

4Muller HL，Oh Y，Lehrnbecher T，etal.Insulin-like growth factor-binding protein-2 concentrations in cerebrospinal fluid and serum of children with malignant solid tumors or acute leukemia〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，1994;79(2)：428-34.

5Godard S，Getz G，Delorenzi M，etal.Classification of human astrocytie gliomas on the basis of gene expression：a correlated group of genes with angiogenic activity emerges as a strong predictor of subtypes〔J〕.Cancer Res，2003；63：6613-25.

6Wang GK，Hu L，Fuller GN，etal.An interaction between insulin-like growth factor binding protein 2(IGFBP2) and integrin alpha 5 is essential for IGFBP-2.induced cell mobility〔J〕.J Biol Chem，2006；281：14085-91.

7Wang H，Wang H，Shen W，etal.Insulin-like growth factor binding protein 2 enhances glioblastoma invasion by activating invasion-enhancing genes〔J〕.Cancer Res，2003;63：4315-21.

8Zhou YH，Hess KR，Liu L，etal.Modeling prognosis for patients with malignant astrocytic gliomas：quantifying the expression of multiple genetic markers and clinical variables〔J〕.Neuro-oncol，2005;7：485-94.

9Zhang w，Wang H，Song SW，etal.Insulin-like growth factor binding protein 2:gene expression microarrays and the hypothesis-generation paradigm〔J〕.Brain Patho,2002;12(1):87-94.

10Lin Y, Jiang T, Zhou K,etal. Plasma IGFBP-2 levels predict clinical outcomes of patients with high-grade gliomas 〔J〕. Neuro Oncol, 2009;11(5):468-76.

11李方成,戴学元,陶宗玉,等.胰岛素样生长因子结合蛋白-2在脑胶质瘤中的表达及意义〔J〕.中华实验外科杂志,2004;21(5)： 594-5.

12Yang P, Yan W, Zhang W，etal.Whole-genome messenger RNA profiling reveals genes involved in malignant progression of glioma〔J〕.Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2013;93(1):5-7.

13Han S, Meng L, Han S,etal.Plasma IGFBP-2 levels after postoperative combined radiotherapy and chemotherapy predict prognosis in elderly glioblastoma patients〔J〕. PLoS One,2014;9(4):e93791.

14Paddison PJ,Caudy AA,Bemstein E.Shore baipin RNAs(shRNA) induce sequence-specific silencing in mammalian cells〔J〕.Genes Dev,2002;16(8):948.