甘油果糖氯化钠注射液灭菌前已灌封样品的微生物限度检查法的建立

王林 黄加秀 谢春娟 石晶萍 朱佳丽 周海强 范彪

甘油果糖氯化钠注射液是高渗制剂, 于1993年在我国批准上市, 通过高渗透性脱水, 能使脑水分含量减少, 降低颅内压［1］。主要用于脑血管疾病、脑外伤、脑肿瘤、颅内炎症及其他原因引起的急慢性颅内压增高、脑水肿等症的治疗［2］。

根据新版GMP要求, 应当依据所用灭菌方法的效果确定灭菌前产品微生物污染水平的监控标准。企业在日常生产过程中应做好微生物的污染水平的监控工作, 对产品含菌量的变化进行趋势分析, 以便及时发现不良趋势, 采取相应措施确保产品的无菌水平［3］。这就要求对微生物检测方法进行验证以保证方法的可靠性和有效性, 准确了解产品的微生物污染水平［4］。作者在此建立了甘油果糖氯化钠注射液灭菌前已灌封样品的微生物限度检查方法, 并进行了方法学验证。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 代试品 甘油果糖氯化钠注射液配制液(批号：13101221、13101421、13101821、13102021, 扬子江药业集团有限公司)。

1.1.2 试验用菌种(第四代) 金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］、大肠埃希菌［CMCC(B)44102］、白色念珠菌［CMCC(F)98001］、黑曲霉菌［CMCC(F)98003］均来自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.3 稀释液、缓冲液 0.9%无菌氯化钠溶液(批号：13120141)、pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号：13090221), 均为自制。

1.1.4 培养基 营养琼脂培养基(批号：1306202)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号：1307252)、改良马丁培养基(批号：1307222)、营养肉汤培养基(批号：130708)、改良马丁琼脂培养基(批号：121012)均由北京三药科技开发有限公司提供。

1.1.5 仪器 HTY-601型智能集菌仪(杭州高得泰林生物技术设备有限公司)；HTY型反复使用全封闭集菌培养器 (杭州高得泰林生物技术设备有限公司)； LRH-250型恒温培养箱(上海索普仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备 分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基, 30～35℃培养18～24 h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中, 23～28℃培养24～48 h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成含50～100 cfu/ml的菌悬液； 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中, 培养5～7 d, 使大量孢子产生, 加入3～5 ml含0.05%(v/v)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液, 将孢子洗脱, 然后吸出孢子悬液(管口带有薄的无菌棉花过滤菌丝)至灭菌试管内, 用含0.05%(v/v)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将菌液稀释至50～100 cfu/ml的菌悬液, 备用。

1.2.2 细菌、霉菌及酵母菌检查方法的验证(预实验 批号：13101221)

1.2.2.1 试验组 取配制液100 ml至集菌培养器中, 并分别加入50～100 cfu的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌悬液, 过滤, 取出滤膜, 菌面朝上贴至营养琼脂培养基平板上, 于30～35℃倒置培养3 d。取配制液100 ml, 至集菌培养器中, 分别加入50～100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉菌悬液, 过滤, 取出滤膜, 菌面朝上贴至玫瑰红钠琼脂培养基平板上, 于23～28℃倒置培养5 d。

1.2.2.2 菌液组 方法同试验组, 不加供试液。测定每一菌株所加的试验菌数。

1.2.2.3 供试品对照组 照试验组项下操作, 不加菌悬液,作为供试品本底菌数。回收率的计算公式。

3 结果

细菌、霉菌及酵母菌验证结果(预试验回收率%)。见表1。

以上各菌回收率均>70%, 符合规定。故采用3个批号的样品按照上述方法进行3次独立试验。结果见表2。

表1 细菌、霉菌及酵母菌验证结果(预试验回收率%)

表2 细菌、霉菌及酵母菌验证结果(菌株回收率%)

经过3次独立试验, 以上各菌的回收率均符合规定, 且长势相同。故采用该方法再对3批配制液进行微生物限度检查, 结果见表3。

表3 3批配制液的微生物限度检查结果(n)

3 小结

为确保无菌药品的安全有效, 作者在注射液进行最终灭菌前, 对其配制液进行微生物限度检查, 有效监控其微生物污染状况。经查阅相关文献并未发现针对最终灭菌大容量注射剂配制液的微生物限度有明确的限度规定, 为规范无菌制剂生产过程中最终灭菌前产品微生物的质量监控, 保证药品质量, 本企业制定了甘油果糖氯化钠注射液灭菌前配制液的微生物限度：细菌、霉菌及酵母菌总数应不得过10 cfu/100 ml。验证方法建立后, 取3批样品按此方法检验, 检查结果均符合规定。

［1］于振国, 娄飞云.甘油氯化钠注射液降低颅内压52例临床观察.蚌埠医学院学报, 2001, 26(1):23.

［2］丁汉锦.甘油氯化钠注射液消除脑水肿、降低颅内压临床观察.蚌埠医学院学报, 2002, 27(6):529-530.

［3］曹元, 梁毅.无菌药品灭菌前微生物控制研究.中国药业,2009.18(22):9-11.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部).北京:国医药科技出版社, 2010:(附录)103-107.