鼻咽癌中环氧化酶-2的实验研究

陈广理 王俊周 郭晓民 杨明

环氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)是前列腺素(PGs)合成过程中主要限速酶, 不仅在炎症等过程中发挥重要作用, 而且还与肿瘤的增生、浸润和转移密切相关［1］。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是具有极高的浸润和转移能力的肿瘤本实验通过RT-PCR方法研究在鼻咽癌中COX-2的表达, 探讨COX-2在鼻咽癌的增生、浸润及转移中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 鼻咽癌及相应癌旁组织26例, 来源于本院鼻咽部活检标本, 其中有淋巴结转移病例19例、无淋巴结转移病例7例。癌旁组织取自肿瘤边缘5 mm以外区域, 10例正常鼻咽部黏膜组织取于鼻咽部正常的手术患者。病理学诊断均为鳞状细胞癌, 其中高分化3例、中分化4例、低分化19例。其中男19例, 女7例, 年龄最小27岁, 最大78岁,平均年龄(48.026±5.517)岁, 术前均未经化疗或放疗。

1.2 主要试剂与仪器 逆转录酶MLV(MBI), TRIzol试剂(GibCO),dNTP(MBI), TaqDNA聚合酶(MBI), GDS8000型凝胶成像系统(UVP), PTC-200 PCR仪(MJA), Grab-it 4.0分析软件为Gelworks 1D interdiate, DU650型紫外光分光光度仪(BECKMAN)。

表1 PCR 引物序列和 PCR产物片断长度

1.3 引物设计 泳道M：Marker；泳道1～2分别是COX-2 mRNA在无淋巴结转移的鼻咽癌组织和有淋巴结转移鼻咽癌组织中的PCR产物(236 bp)；泳道3～4分别是COX-2 mRNA在癌旁组织和正常鼻咽部黏膜中的PCR产物(236 bp)。见表1。

1.4 组织RNA提取和cDNA合成 取约50 mg组织放入匀浆器中, 匀浆加入1 ml TRIzol, 用氯仿和异丙醇逐步提取RNA, 溶于焦碳酸二乙脂水中, 然后应用紫外分光光度仪检测定量。

1.5 RT-PCR反应 以cDNA为模板, 扩增COX-2 (236 bp)及β-actin (300 bp)等基因片断。

PCR 反应体系为 25 μl, 含上述基因 cDNA 2.0 μl, dNTP 的终浓度0.2 mmol/L, 10×Buffer 2.5 μl, Mg2+的终浓度2.0 mmol/L,TaqDNA聚合酶1 U, 上游和下游引物的终浓度各0.2 μmol/L。β-actin为内参照物。

PCR反应条件为95℃预变性5 min, 95℃ 1 min、50℃1 min、72℃ 1 min, 然后72℃延伸5 min。反应结束后取5 μl产物电泳, 用grab-It成像系统照像, 然后分析各条带的积分吸光密度值, 以目的基因与β-actin的相对积分吸光密度值记录结果。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 在鼻咽癌组织中COX-2 mRNA高表达, 在正常鼻咽部黏膜中低表达 本实验研究表明COX-2 mRNA在全部鼻咽癌组织中高表达, 见图1, COX-2 mRNA在无淋巴结转移的鼻咽癌组织、有淋巴结转移鼻咽癌组织中平均相对吸光度值分别为：(0.7632±0.0411)和(0.7951±0.0364), 二者之间差异无统计学意义(t=1.371, P>0.05)。

2.2 在鼻咽癌癌旁组织和正常鼻咽部黏膜中COX-2 mRNA低表达, 见图1, 相对平均吸光度值分别为：(0.2069±0.0372)、(0.2183±0.0417)。二值差异无统计学意义(t=1.358, P>0.05)。

图1 在鼻咽癌组织、癌旁组织和正常鼻咽部黏膜中COX-2 mRNA的表达

2.3 在鼻咽癌组织中COX-2 mRNA的表达与在正常鼻咽部黏膜COX-2 mRNA的表达之间, 差异均具有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

鼻咽癌为我国最常见的恶性肿瘤之一, 是极易转移的肿瘤, 通常颈淋巴结转移常为患者最早发现的体征, 颈部肿块为此病首发者约占60%。COX-2在正常组织中不表达或微量表达, 而在病理情况下, COX-2在炎症、肿瘤等组织中表达增高, COX-2的高表达与多种肿瘤的发生发展关系密切［1］。本实验检测表明, COX-2在鼻咽癌组织中均高表达, 在癌旁组织和正常鼻咽部黏膜中低表达。本实验结果表明, 鼻咽癌的增长、浸润及转移与COX-2的高表达有密切的关系。

3.1 COX-2促进肿瘤新生血管的形成血管内皮生长因子(VEGF)是促进肿瘤新生血管生成的作用最强的因子之一。在肿瘤中高表达的COX-2可促使VEGF生成增加, COX-2与VEGF协同作用, 促进肿瘤新生血管的生成［2］。文献报道,在鼻咽癌中VEGF高表达, 鼻咽癌的失控增殖能力与VEGF的高表达有密切关系。结合本实验结果, 在鼻咽癌组织中COX-2高表达, 表明COX-2与VEGF共同促进鼻咽癌新生血管的生成。

3.2 COX-2促进肿瘤细胞的增殖 在肿瘤中COX-2高表达, 促进肿瘤合成大量PGs, 进而促进肿瘤细胞增殖［3］。结合本实验结果, COX-2在鼻咽癌组织中均高表达, 表明COX-2促进了鼻咽癌细胞的增殖。

3.3 COX-2促进肿瘤的浸润和转移 研究表明, 在肿瘤组织中COX-2表达增高, 同时有基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的表达升高, E-钙粘连素的表达降低, 共同促进了肿瘤细胞的浸润和转移。鼻咽癌是具有极高浸润和转移能力的肿瘤, 本实验结果显示, COX-2在鼻咽癌组织中均高表达, 表明COX-2促进了鼻咽癌细胞的浸润和转移。

综上所述, 鼻咽癌中COX-2表达升高, 说明了鼻咽癌细胞的增生、浸润及转移与COX-2的高表达有密切关系。因此,COX-2成为了研究和治疗肿瘤的重要靶分子之一, 在抗肿瘤的研究治疗中有重要的意义。

［1］Fukazawa EM, Baiocchi G, Soares FA, et al.Cox-2, EGFR, and ERBB-2 Expression in Cervical Intraepithelial Neoplasia and Cervical Cancer Using an Automated Imaging System.Int J Gynecol Pathol, 2014, 33(3):225-234.

［2］Nagoya H, Futagami S, Shimpuku M, et al.Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1 is associated with angiogenesis and VEGF production via upregulation of COX-2 expression in esophageal cancer tissues.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2014,306(3):183-190.

［3］Zhao H, Luo F, Li H, et al.Antinociceptive Effect of Tetrandrine on LPS-Induced Hyperalgesia via the Inhibition of IKKβ Phosphorylation and the COX-2/PGE2 Pathway in Mice.PLoS One,2014, 9(4):e94586.