16S rRNA基因序列分析在人体微生物组学研究中的进展及应用

田芳云 黄婷婷 黄光武 张 哲

(广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科,广西 南宁 530021)

在人体表面以及与外界相通的腔道中，如皮肤、胃肠道、鼻腔等部位，定植着大量以细菌为主的微生物群落。这些微生物的数量可达人体自身细胞数的10倍以上，其基因数量更多达人体基因数的100多倍〔1〕。微生物群落在人体内维持一定的动态平衡，参与调节人体的一系列生理生化反应，如免疫调节、食物消化、维生素合成等。因此，微生物群落的平衡失调可能导致各种感染性、过敏性疾病甚至肿瘤的发生。人体微生物组的概念最早在2001年提出，是对人体共栖、共生和致病的所有微生物的总称。微生物基因组是人体基因组中不可缺少的组成部分，人体微生物组测序也被认为是"人体第二个基因组计划"〔2〕。近年来随着分子生物学技术的飞速发展，特别是DNA测序技术的进步，人们对人体微生物组的研究更加深入，使得微生物组在人体健康与疾病中扮演的角色越来越受到重视。

1 人体微生物组的研究

2007年，美国国立卫生院(NIH)正式宣布启动人体微生物组计划(Human Microbiome Project, HMP)，其主要包括：(1)对正常人体不同部位的微生物群落进行高通量测序研究，全面了解人体微生物群落的特点；(2)分析微生物群落的改变是否和人体健康或疾病相关；(3)建立标准化的微生物样本采集方法、分析程序、微生物数据库，为其他相关科研提供数据和技术支持〔2〕。HMP第一阶段研究成果已于2012年相继公布在Nature和PLoS等杂志上，研究者分析了242个健康人的4 788份样本，通过16S rRNA基因测序分析得到5 177份微生物分类单元，其分类覆盖了人体微生物属的81%～99%；并通过鸟枪法全基因组测序分析得到近800个菌种的基因组序列。研究还发现个体之间微生物群落各有特点，没有任何一种细菌普遍存在于所有人体的所有部位，人体不同部位都至少有一种占主导地位的优势菌群〔3～5〕。HMP第二阶段的研究仍在进行中，其将具体分析微生物菌落在人体疾病发生发展过程中的作用。

2 微生物组学研究的方法

人们对微生物组的认识在很大程度上取决于研究手段。传统的鉴定手段主要基于微生物的培养方法，目前主要应用于微生物生长、代谢等功能研究以及对抗生素敏感性和致病性的评价。但此法耗时长、特异性差，且几乎99%的微生物不可在实验室环境下培养〔6〕，这极大限制了人们对微生物的研究。1998年Handelsman等〔7〕提出了宏基因组学的概念，旨在对环境中全部微生物基因组进行研究，从而了解它们的种群结构、多样性、功能活性、相互关系及对环境的影响等。宏基因组学研究包括了可培养、非可培养的微生物，对特定环境微生物菌群的研究更全面更具体；其研究策略主要有16S rRNA基因测序分析和全基因组测序分析〔8,9〕(16S rRNA基因测序与全基因组测序的对比见表1)。

2.116S rRNA基因测序 16S rRNA基因测序主要用于菌群构成和物种多样性等分析。16S rRNA基因是核糖体30S亚基的组成部分，其长度适中，约为1 500 bp，存在于所有的细菌、衣原体、立克次体、支原体、螺旋体及放线菌等原核生物中，但不存在于病毒或真菌等非原核生物内。16S rRNA基因由交错排列的可变区和保守区组成，保守区为所有细菌所共有，可变区在不同细菌之间存在不同程度的差异，具有属或种的特异性。通过对可变区或全长序列的分析及同源性比较，可以计算不同菌属和菌种在遗传进化的距离〔10〕。近年来随着测序技术发展，特别是第二代高通量测序技术的成熟，16S rRNA基因数据库得到了极大丰富。到2013年10月为止，Ribosomal Database Project (RDP)数据库记录了280 940 6条细菌和古生菌的16S rRNA基因序列，并做了注解和归类〔11〕，这为16S rRNA基因测序用于微生物的鉴定提供了有力的数据支持。

2.2全基因组测序 全基因组测序通过对环境中全部微生物的全组DNA进行测序分析，不但能了解微生物群体的多样性及丰度，还能发掘和研究具有特定功能的新基因，鉴别某些以16S rRNA基因测序难以鉴别的微生物种类〔1,12〕。但也存在如下问题：由于目前DNA提取方法的限制，无法取得所有微生物全部的DNA序列，提取过程中易受外界DNA干扰；缺乏合理有效的质量控制，操作繁琐，人力物力耗费大；序列信息分析复杂等〔13〕(见表1)。

表1 16S rRNA基因测序与全基因组测序方法的比较

3 16S rRNA基因序列分析在人体疾病中的研究

3.1肠道菌群失衡与疾病 人体肠道内的细菌数约有1 014个〔14〕，人们通过16S rRNA基因测序分析发现肥胖、代谢综合征、Ⅱ型糖尿病以及肠道炎症等与肠道细菌结构和数量失衡密切相关。Walker等〔15〕通过对多名克罗恩病、溃疡性结肠炎患者及健康对照的肠道标本分析发现，炎性肠疾病者的菌群多样性明显减少，菌群结构也发生改变，其中厚壁菌明显减少而拟杆菌增加。Larsen等〔16〕发现Ⅱ型糖尿病患者肠道中厚壁菌数量明显减少，而拟杆菌、变形菌门比例升高，且拟杆菌和厚壁菌的比值与糖耐量下降密切相关。2011年一项对卡路里摄入及粪便菌群的研究发现，饮食能在短时间内引起肠道菌群结构发生改变，从而影响肠道营养及能量的吸收，如高能量的饮食则会引起肠道厚壁菌门数量增多，增加肠道能量吸收，同时减少粪便中卡路里含量〔17〕。这些研究不仅科学地诠释了人体健康与肠道菌群的微妙关系，还有助于预防和干预由肠道菌群失衡引发的肥胖、肠炎和糖尿病等疾病。

3.2阴道菌群失衡与疾病 目前通过16S rRNA基因测序已鉴定出约20种存在于女性阴道内的乳酸杆菌。大部分健康(正常)妇女阴道菌群以卷曲乳酸杆菌、惰性乳杆菌、加氏乳杆菌和詹氏乳杆菌中的1～2种为主，且数量占到95%的绝对优势〔18,19〕。乳酸杆菌产生的过氧化氢、乳酸及细菌素对于维持阴道微环境稳定十分重要，因此其数量改变可引起常见阴道炎症性疾病，Liu等〔20〕通过对比健康妇女、细菌性阴道炎(BV)患者、阴道念珠菌病(VVC)患者、合并VVC和BV患者的阴道分泌物发现，乳酸杆菌属含量最低但菌群种类最多的是BV患者，其次为合并有VVC与BV的患者。王克迪等〔21〕的研究表明，BV患者阴道菌群表现为乳酸杆菌显著减少甚至缺失，而其他的杂菌如加德纳菌、普雷沃氏菌属等占优势，并有厌氧菌共存。

3.3口腔菌群失衡与疾病 2008年人体口腔微生物组数据库(HOMD)正式启动，该数据库主要建立在16S rRNA基因序列分析的基础上，记录了13门 619种口腔微生物分类。Dewhirst等〔22〕进一步研究了正常口腔菌群中36 043个16S rRNA基因克隆，鉴定出1 179种细菌分类，其中68%此前未被培养，经鉴定将有434个新的细菌种属增加到HOMD中。Yang等〔23〕结合16S rRNA基因和全基因组测序技术发现龋病患者和无龋者微生物群落构成明显不同，无龋病个体微生物组较单一，而龋病患者微生物构成复杂多样，其中有147个细菌操作分类单位(OTUs)与龋齿有关，可作为评估龋病风险和预后的指标〔23〕。

3.4皮肤菌群失衡与疾病 2009年Grice等〔24〕鉴定出19个门205个属的细菌，根据与人体的关系分为以葡萄球菌、丙酸菌等为主的共生菌，以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等为主的致病菌，该研究成果发表在Science杂志上。人类很多皮肤疾病都与菌群结构和丰度改变有关。基于16S rRNA基因的非培养技术研究发现，痤疮患者的毛囊内除了常见的丙酸菌外还鉴定出少量此前未被培养出的放线菌、颗粒丙酸菌、普氏厌氧球菌等，但健康者的毛囊中细菌相对单一〔25,26〕。Statnikov等〔27〕发现银屑病皮损部位、银屑病外观正常皮肤、正常皮肤之间的微生物群落结构存在显著差异，这为区分这三种皮肤提供重要的理论依据并指导针对性治疗。

3.5鼻咽部菌群失衡与疾病 鼻咽部菌群的改变可引起急性中耳炎、鼻窦炎、口腔炎、上呼吸道感染甚至肺炎等〔28,29〕，Hilty等〔30〕发现58个细菌科，其中以莫拉菌科、链球菌科、巴斯德氏菌科最为常见，中耳炎患者鼻咽部共生菌群相对健康者明显减少，而肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等致病菌明显增加。另一项研究发现儿童鼻咽部菌群在秋冬季存在明显差异，且这种差异性不受抗生素、性别、年龄的影响，因此推测鼻咽部菌群的改变可能是儿童在秋冬季好发呼吸道感染性疾病的病因〔31〕。对鼻咽部菌群的分析，将为对某些上呼吸道疾病、中耳炎等的病原分析方面提供依据，从而指导治疗。

4 基于16S rRNA基因的非培养技术在人体微生物组学研究和应用的展望

共生微生物与人体保持着动态平衡，这对维护机体健康起着十分重要的作用。人体各部位细菌结构存在明显差异，即使在同一部位也存在着一定的个体差异，因此对人体微生物进行鉴定并对它们的生理功能进行解析，建立人体微生物组数据库，可为疾病的病因分析及预防、治疗等方面提供新思路新方法。基于16S rRNA基因的非培养技术是一种快速、敏感特异性高的微生物鉴定方法，第二代测序技术的飞速发展使16S rRNA基因高通量测序成为可能，并让微生物组学研究尤其是微生物鉴定、多样性分析以及相关的应用更为广泛和准确。这些研究手段和成果可以进一步揭示人体微生物组学在疾病发生发展过程中扮演的角色，并最终应用于临床疾病的诊断和指导治疗。

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