头孢曲松钠对脑缺血再灌注模型大鼠的脑保护作用

颜志婷 熊建忠 林小小 黄乐松 (萍乡市人民医院药剂科，江西 萍乡 337055)

兴奋性氨基酸的毒性作用在脑缺血再灌注损伤中起着重要作用。谷氨酸是脑内必需的兴奋性神经递质之一，兴奋性氨基酸转运体2是最主要的谷氨酸转运体，负责脑内90%以上的谷氨酸再摄取，调节突触间隙的谷氨酸浓度，在多种神经退行性疾病的发病过程中起重要作用。文献表明〔1，2〕，多种β-内酰胺类抗生素如头孢曲松钠等是兴奋性氨基酸转运体2的转录激活剂，可以增加兴奋性氨基酸转运体2的蛋白表达水平，产生神经保护作用。本研究探讨头孢曲松钠预处理对缺血性损伤脑保护的可能作用。

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂 肿瘤坏死因子(TNF)-α的PCR引物(上海生物工程技术有限公司合成)。头孢曲松钠(台湾泛生制药厂股份有限公司提供，批号:1010050);2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色剂(TTC，青岛高科园海博生物技术有限公司提供)。

1.2 实验分组 雄性SD大鼠36只，体重250～300g，随机分为3组:(1)假手术组(大鼠于手术前5 d开始注射头孢曲松钠，连续5 d，每天1次)。(2)生理盐水(手术前5 d开始注射等量的生理盐水，连续5 d)。(3)头孢曲松钠(手术前5 d开始注射头孢曲松钠，连续5 d)。

1.3 脑缺血再灌注模型的制作 以Longa改良法制备大鼠缺血再灌注模型。麻醉，颈部正中切口，在大鼠颈总动脉分叉处剪一小口，沿颈内动脉向颅内插入鱼线(18.5±1.5)mm，栓塞90 min后将鱼线拔出。假手术组鱼线插入深度为10 cm，其余步骤同Longa改良法。

1.4 取材和HE染色 大鼠缺血再灌注24 h后，麻醉。生理盐水和4%多聚甲醛PBS液进行心脏灌注。断头取脑组织块，固定，脱水，包埋，连续切片。常规HE染色。光镜观察，摄片。

1.5 TTC染色与脑缺血体积的测定 在缺血再灌注48 h后，每组取6只大鼠10%水合氯醛深度麻醉，快速断头取脑。将鼠脑立即置于-20℃冰箱中10 min后取出，行2 mm厚连续冠状切片，共5片。将切片立即置于2%TTC溶液中，37℃恒温下避光染色30 min，然后置于4℃ 4%多聚甲醛溶液中固定24 h。正常脑组织染为红色，梗死组织为白色。分离苍白区 (梗死区)和非苍白区(正常区)，梗死百分比(%)=苍白区重量/(苍白区重量 +非苍白区重量 )×100%〔3〕。

1.6 大鼠神经功能缺损评分 参照Bederson等确立的5级评分法对大鼠的神经功能缺损进行评分，分值越高，动物行为障碍越严重。0分:大鼠无神经损伤症状。1分:大鼠不能完全伸展对侧前爪。2分:大鼠向对侧转圈。3分:大鼠向对侧倾倒。4分:大鼠不能自发行走，意识丧失。

1.7 TNF-α mRNA检测 大鼠缺血再灌注48 h后断头取脑，取脑组织，迅速用液氮冷冻，并放置于-70℃保存。RNA提取采用异硫酸胍法。TNF-α上游引物:5＇CTCAAAACTCGAGTGACAAGC3＇，下游引物:5＇CCGTGATGTCTAAGTACTTGG3＇;GAPDH 上游引物 5＇AGTTCAACGGCACAGTCAAGG3＇，下游引物 5＇CTCAAAACTCGAGTGACAAGC3＇。逆转录及cDNA扩增，参照相关文献进行。反应条件:94℃ 2 min，然后按9℃ 1 min，50℃1 min，72℃ 1 min运行30个循环，最后72℃延伸7 min。取出10 μl PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后照相，利用图像分析系统对产物条带进行灰度扫描，TNF-α与内对照GAPDH的灰度比值即为其mRNA表达半定量结果。

1.8 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件。多组间比较采用单因素方差分析。方差齐用Bonferroni法。方差不齐采用Welch法和Dunnett法。

2 结果

2.1 行为学结果 假手术组大鼠神经无神经功能缺损，神经功能评分为0分。生理盐水组大鼠有明显神经功能缺失，神经功能评分增高。头孢曲松钠组大鼠神经功能评分下降，与生理盐水组相比，差异有统计学意义。见表1。

2.2 TTC染色结果 假手术组TTTC染色均为红色，脑组织无缺血灶。生理盐水组相对脑缺血体积增加。头孢曲松钠组相对脑缺血体积下降，与生理盐水组相比差异显著。见表1。

2.3 TNF-α mRNA表达 假手术组脑组织中仅有少量TNF-α表达，生理盐水组脑组织中TNF-α表达明显增高，灰度值增加，头孢曲松钠组脑组织中TNF-α表达减少，灰度值下降，与生理盐水组相比，差别有统计学意义。见表1，图1。

2.4 HE染色结果 假手术组大鼠大脑皮质组织形态结构无明显的变化，细胞膜完整，染色质均一。生理盐水组可见皮质神经元灶性或片状坏死，间质及神经元水肿明显。头孢曲松钠组神经元坏死减少，神经元及间质水肿明显减轻。

表1 各组大鼠神经功能评分，TNF-α mRNA表达，相对脑缺血体积比较(s，n=12)

表1 各组大鼠神经功能评分，TNF-α mRNA表达，相对脑缺血体积比较(s，n=12)

与生理盐水组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

组别 神经功能评分(mm3)相对脑缺血体积(%)TNF-α 灰度值生理盐水组 2.413 ±0.525 24.472 ±3.08 0.897±0.029假手术组 02) 02) 0.112±0.0072)头孢曲松钠组 1.325 ±0.2431) 16.156±2.6832) 0.421±0.0161)

图1 TNF-α mRNA的表达

3 讨论

缺血性脑血管病是威胁人类生命健康的主要疾病之一，薛敏等〔4〕研究认为，年龄、吸烟、高血压、糖尿病、心房颤动及高高同型半胱氨酸血症、抗血小板药物依从性均为缺血性脑卒中患者复发的危险因素。文献表明〔5〕，缺血性脑损伤时的脑组织可能产生大量的兴奋性氨基酸，其中谷氨酸盐的释放占有重要作用。突触内谷氨酸浓度升高引起的一个效应就是N-甲基-D-天冬氨酸受体的激活。N-甲基-D-天冬氨酸受体是钙通透性的，能引起广泛的膜去极化和钙内流，加剧细胞内Ca2+超载。激活DNA酶、蛋白酶和磷脂酶等，并生成自由基，破坏生物膜，引起迟发性神经元死亡。N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂，在动物实验中被证实有神经保护作用〔6〕。但是也有临床研究认为在急性缺血性脑卒中发病6 h内静脉使用N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂并无益处〔7〕，而且另一种谷氨酸受体拮抗剂加维斯替奈的相关临床试验结果亦显示不佳〔8〕。这可能脑缺血后脑组织内谷氨酸盐迅速增高，而临床治疗却在脑梗死后几小时进行，而此时脑组织内谷氨酸盐已达到高峰。

头孢曲松钠是第三代头孢类抗生素。有研究发现在大鼠脑缺血前给予头孢曲松钠预处理对缺血性脑损伤有一定的脑保护作用。本研究证实，在大鼠脑缺血前给予头孢曲松钠预处理能起到缓解缺血后脑损伤的作用。头孢曲松钠对缺血后损伤的脑保护作用可能与降低肿瘤坏死因子TNF-α表达有关，它可能抑制胶质产生谷氨酸载体，同时可能促进谷氨酸盐的转运〔9〕。另外，头孢曲松钠预处理能增加脑缺血后谷氨酸载体的表达〔10〕，加速缺血后突触内谷氨酸盐的转运，从而减少兴奋性氨基酸的毒性作用。

1 刘兴山，崔 淼，董 雪，等.运用临床路径对缺血性脑卒中患者实施健康教育的效果〔J〕.中国老年学杂志，2013;33(16):3961-2.

2 许保磊，王 蓉.兴奋性氨基酸转运体2在神经退行性变中的作用〔J〕.中国比较医学杂志，2012;22(10):67-71.

3 Hou ST，MacManus JP.Molecular mechanisms of cerebral ischemia-induced neuronal death〔J〕.Int Rev Cytol，2002;221(1):93-148.

4 薛 敏，张 梅，朱 蕾，等.缺血性脑卒中复发的相关危险因素分析〔J〕.中国基层医药，2013;20(14):2081-3.

5 李 军，曾邦雄.脑缺血性损伤级联反应的研究进展〔J〕.国外医学·麻醉学与复苏分册，2001;22(6):364-8.

6 李淑兰，刘凤莲，王学斌，等.谷氨酸及其受体在脑内的存在作用与谷氨酸的神经毒性〔J〕.中国临床康复，2004;8(22):4553-5.

7 徐 恩，缪学琼，李 雯，等.神经保护药物治疗缺血性脑卒中的最新进展〔J〕.中国处方药，2006;2:38-41.

8 Sacco RL，DeRosa JT，Haley EC Jr，et al.Glycine antagonist in neuroprotection for patients with acute stroke:GAIN Americas:a randomized controlled trial〔J〕.JAMA，2001;285:1719-28.

9 Pickering M，Cumiskey D，O＇Connor JJ.Actions of TNF-alpha on glutamatergic synaptic transmission in the central nervous system〔J〕.Exp Physiol，2005;90(4):663-70.

10 Chu K，Lee ST，Sinn DI，et al.Pharmacological Induction of Ischemic Tolerance by Glutamate Transporter-1(EAAT2)Upregulation〔J〕.Stroke，2007;38(1):177-82.