大鼠肾发育中Cyt-c的表达

庞 娟 宋小峰

(辽宁医学院，辽宁 锦州 121001)

细胞凋亡是受多种基因精确调控的主动的程序化的死亡过程，在多细胞生物的组织分化、器官发育和机体稳态的维持中发挥着重要的作用〔1〕。细胞色素C(Cyt-c)是线粒体中第一个被鉴定出的细胞凋亡因子，在细胞凋亡过程中Cyt-c释放进入胞质，是线粒体释放的最重要的促凋亡因子之一〔2〕。细胞凋亡在肾各结构的发育中起着重要的作用〔3，4〕。目前，有关肾发育中细胞凋亡的相关研究国外已有一定报道，但正常肾发育中凋亡相关蛋白Cyt-c的表达及作用的系统研究还很少见，其对肾发育的影响还有待进一步的完善〔5〕。本研究拟探讨大鼠肾发育中Cyt-c的表达规律及对肾发育的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物和抗体 选用成年健康SD大白鼠，雌、雄(2∶1)同窝饲养,3次/d观察受孕情况，以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚龄(E)0 d。孕鼠分笼饲养2 w后，2次/d观察生产情况，以观察到仔鼠出生的最早时间计为生后(P)0 d。选取E16、18、20 d的胎鼠和P1、3、5、7、14、21 d的仔鼠，每组取6只。

抗体：鼠抗Cyt-c单克隆抗体(购于Abcam公司)； PV试剂盒(购于北京中杉试剂公司)。

1.2石蜡切片的制备 各龄孕鼠经腹腔注射水合氯醛麻醉后剖腹取出胎鼠，各龄胎鼠剖腹取肾；生后各龄仔鼠经乙醚麻醉后，经4%多聚甲醛与1%戊二醛灌流固定，取肾，常规脱水透明，石蜡定向包埋，连续切片(5 μm厚)。

1.3PV法检测Cyt-c阳性表达细胞 将石蜡切片脱蜡至水；3%H2O2阻断内源性过氧化物酶；高温高压修复，室温下冷却；鼠抗Cyt-c单克隆抗体 (1 μg/ml)湿盒内4℃过夜;羊抗鼠IgG,37℃20 min; 二氧基联苯胺(DAB)显色;苏木精复染、脱水、透明、封片;以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照，光镜下观察。

1.4免疫印迹法检测细胞增殖 收集待用肾组织，加入100 μl 蛋白提取缓冲液，于组织匀浆机上匀浆后，4℃、10 000 r/min离心10 min，取上清，置于-70℃备用。电泳前，加入十二烷硫酸钠(SDS)样品缓冲液，100℃煮沸5 min，10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离，然后将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h， 鼠抗Cyt-c单克隆抗体(1 μg/ml)4℃孵育过夜，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜10 min 3次，辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗兔IgG(1∶2 000)二抗孵育2 h，TBST洗膜10 min 3次，增强化学发光法(ECL)显影。

图1 Cyt-c蛋白免疫组织化学显色

2 结 果

2.1Cyt-c蛋白免疫组织化学显色 见图1。Cyt-c阳性表达定位于细胞质上，呈不同程度的棕黄色颗粒状，而Cyt-c阴性细胞的细胞核被苏木精染成蓝紫色。从E16～20 d时，皮质区Cyt-c的阳性细胞主要出现于近髓质区的近端小管和远端小管内，近端小管的表达强于远端小管，肾小体内的阳性表达细胞极少见；髓质区的阳性表达细胞主要出现在与梯状间充质垂直排列的放射状小管内。P1～7 d时，皮质区Cyt-c的阳性表达细胞随着生肾区的变薄逐渐增多，主要表达中层和深层的肾皮质区，髓放线的阳性表达细胞也逐渐增多，但仍集中在放射状小管上。P14～21 d时，皮质区的阳性表达细胞位于皮质全层；髓质区的阳性表达细胞较多，以外髓放射状走行的小管居多。

2.2免疫印迹分析结果 免疫印迹结果显示，大鼠肾发育中Cyt-c的蛋白表达从E16 d～P7 d逐渐升高，P7 d时达到高峰，以后则逐渐降低，在P7 d后表达微弱。见图2。

图2 免疫印迹结果分析

3 讨 论

本研究结果显示，随着发育的不断进行，Cyt-c的表达从皮质的近髓质区逐渐扩展到整个皮质区，其表达主要分布于近端小管和远端小管。

Cyt-c是一个水溶性蛋白质，与线粒体内膜呈松弛相连〔6〕。当发生细胞凋亡时，在凋亡信号的作用下，Cyt-c释放到细胞质并与凋亡蛋白激活因子半胱氨酸蛋白酶原(Apaf-1)聚合，聚合的Apaf-1募集并活化半胱氨酸蛋白酶(pro-caspase-9),caspase-9激活下游的效应酶caspase-3,最终引发线粒体途径介导的细胞凋亡。因此，Cyt-c阳性细胞的多少可以反映细胞的凋亡状态，其表达与线粒体的含量及分布有一定的相关性〔7，8〕。肾近端小管和远端小管的胞质内含有丰富的线粒体。本研究显示，在大鼠胚胎及生后肾的发育过程中Cyt-c均有不同程度的表达，且主要表达于近端小管和远端小管，这或许表明由Cyt-c线粒体通路介导的细胞凋亡与大鼠肾发育密不可分。

本实验发现，Cyt-c的表达从E16 d～P7 d逐渐升高，P7 d达到高峰；通过对肾发育过程中细胞增殖的研究也发现增殖的细胞在P7 d达到高峰，这表明在肾的发育过程中，细胞增殖和细胞凋亡维持着动态平衡，细胞凋亡维持了生物体数目的动态平衡，以消除那些注定要死亡的细胞，以免导致发育异常或肿瘤〔9〕。

在肾发育过程中伴随着细胞生长分化的同时也发生了大量的细胞凋亡，而凋亡过程受到机体的严密监控。对Cyt-c的深入研究将有助于揭示肾发生发育的机制，并为肾疾病的预防及治疗提供新思路。

4 参考文献

1Wyrwicz-Zielinska G, Fedak D, Kuzniewski M,etal.The relationship between serum soluble apoptosis marker (sTRAIL) concentration and nutritional parameters in hemodialyzed patients〔J〕. Przegi Lek, 2013;70 (7):427-30.

2李 慢，韩 芳，石玉秀.细胞色素C氧化酶在PTSD大鼠蓝斑神经元过表达〔J〕. 解剖科学进展, 2010; 16(2):140-2.

3Ye Y, Wang B, Jiang X,etal. Proliferative capacity of stem/progenitor-like cells in the kidney may associate with the outcome of patients with acute tubular necrosis 〔J〕. Hum Pathol, 2011; 42(8): 1132-41.

4Mozaffar MS, Abdelsated R, Liu JY,etal. Renal diatal tubule proliferation and increased aquaporin-2 level but decreased urine osmolality in db/db mouse;treatment with chromium picolinate 〔J〕. Exp Mol Pathol, 2012; 92(1): 54-8.

5Zhang A, Fu S, Chen L,etal. Lacidipine attenuates apoptosis via a caspase-3 dependent pathway in human kidney Cells 〔J〕. Cell Physiol Biochem, 2013;32(4):1040-9.

6Faccenda D, Tan CH, Duchen MR,etal. Mitochondrial IF1preserves cristae structure to limit apoptotic cell death signaling〔J〕. Cell Cycle, 2013;12(16):2530-2.

7Ng H, Smith DJ, Nagley P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/ DIABLO from mitochondria during cell death signaling〔J〕. PloS One,2012;7(7)：e42298.

8Zhang ZF, Guo Y，Zhang JB,etal.Induction of apoptosis by chelerythrine chloride through mitochondrial pathway and Bcl-2 family proteins in human hepatoma SMMC-7721 cell〔J〕.Arch Pharm Res,2011;34(5): 791-800.

9Tang N, Jin J, Deng Y,etal. LASS2 interacts with V-ATPase and inhibits cell growth of hepatocellular carcinoma〔J〕. Sheng Li Xue Bao,2010;62(3): 196-202.