不同浓度TGF-β对内皮细胞锌指基因ZNF580表达的影响

韩国亮 任党丽 赵 英 张 梅 张文成 罗玉玉

(天津医科大学研究生学院，天津 300070)

动脉粥样硬化(AS)是心脑血管疾病的首要病因〔1〕。ZNF580是本课题组以低密度脂蛋白(LDL)诱导人脐静脉内皮细胞得到的一个新基因(GenBank注册号：AF184939)〔2〕，其cDNA编码由172个氨基酸组成的蛋白质，属于C2H2型锌指转录因子家族的新成员。课题组在前期的研究工作中利用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库获得了可能与ZNF580存在相互作用的多种蛋白，并进一步证实在真核细胞中Smad2与ZNF580之间存在相互作用。Smad2是转化生长因子β(TGF-β)信号转导通路的关键分子，此通路的活化参与调节内皮细胞的增殖、凋亡、分化及血管重构与细胞外基质形成等，可能与AS的发生相关〔3～5〕。本研究采用不同浓度TGF-β刺激血管内皮细胞EA.hy926，并检测ZNF580基因表达的改变，进一步阐明ZNF580与TGF-β信号通路间可能存在的关系。

1 材料与方法

1.1材料 人脐静脉内皮细胞株EA.hy926由协和医科大学提供，TRIZOL试剂、TGF-β、RT-PCR试剂盒购自鼎国生物技术公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人脐静脉内皮细胞EA.hy926用含10%小牛血清的高糖DMEM培养基于37℃，5%CO2孵箱培养，2～3 d换液1次。

1.2.2ZNF580、GAPDH引物合成 根据GenBank 发表的ZNF580 cDNA序列设计相应的引物。ZNF580引物:5’- AAA AAG ATC TTG CCC GGA GTG CGC CCG TG-3’，3’- AAA AAG CTT GTG GAG GCG CAC GTG CTG -5’，扩增产物长度为273 bp；GAPDH引物:5’-TGA AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG GT-3’，3’-CAT GTG GGC CAT GAG GTC CAC CAC-5’，扩增产物长度为982 bp。

1.2.3不同浓度TGF-β刺激内皮细胞 取对数生长期EA.hy926细胞接种于6孔板，无血清培养基饥饿12 h后，向每个孔中加入不同浓度的TGF-β ，浓度分别为：0、0.25、0.5、1、2、4 ng/ml。12 h后收集细胞，加入Trizol充分裂解细胞，准备提取总RNA。

1.2.4总RNA提取及鉴定 按Trizol试剂盒说明书提取各组细胞总RNA。紫外分光光度计检测总RNA浓度及纯度。

1.2.5目的片段的RT-PCR扩增 RT反应：按逆转录试剂盒说明操作，每20 μl反应体系内含有4 μl 25 mmol/L MgCl2，2 μl 10×逆转录缓冲液，2 μl 10 mmol/L dNTP混合物，0.5 μl RNA酶抑制剂，1 U AMV逆转录酶，0.5 μg Oligo(dT)引物，2.0 μg RNA模板。以上试剂混合后于42 ℃反应60 min，然后于99 ℃加热5 min，灭活酶活性，立即置冰水浴10 min。

PCR反应：用上述逆转录cDNA为模板扩增ZNF580。每25 μl反应体系内含14.5 μl 2×PCR 缓冲液，2 μl 25 mmol/L MgCl2，2 μl 10 mmol/L dNTP 混合物，0.5 μl(2.5 U)Taq DNA 聚合酶,1 μl 25 pmol/L 引物，5 μl逆转录产物。PCR反应条件：94 ℃ 3 min;30×(94 ℃ 45 s,59 ℃ 45,72 ℃ 1 min );72℃ 10 min。每批模板均同时进行GAPDH的扩增作为内参。PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪照相分析。

2 结 果

2.1总RNA浓度及纯度 成功提取各组细胞总RNA，经紫外分光光度计检测，总RNA浓度及纯度符合RT-PCR反应要求，可以进行RT-PCR反应。见表1。

2.2RT-PCR反应结果 当TGF-β浓度从0.25～2 ng/ml逐渐增加时，ZNF580的表达呈逐渐下降趋势，但继续增加TGF-β刺激浓度至4 ng/ml，ZNF580的表达则有所回升(图1及表1)。

1～5泳道分别代表0.25、0.5、1、2、4 ng/ml TGF-β刺激组，对照组TGF-β刺激浓度为0 ng/ml

表1 总RNA的浓度、纯度及内皮细胞ZNF580基因相对表达量

3 讨 论

近年来，AS所致心脑血管疾病的发病率逐年上升。随着分子生物学技术的发展，研究人员已克隆出诸多和AS相关的基因。人ZNF580基因是以致动脉粥样硬化因素-低密度脂蛋白(LDL)诱导人脐静脉内皮细胞，采用差异显示逆转录-PCR技术分析，以差异表达的ESTs为探针，筛选人主动脉cDNA文库，得到的一个新基因(GenBank注册号：AF184939)〔2〕。其cDNA 748-1266位碱基序列构成一个完整的开放阅读框架，编码172个氨基酸组成的蛋白质。经分子生物学网站进行蛋白质结构功能分析表明：其氨基端5-88位氨基酸序列为脯氨酸富含域，羧基端94-172位氨基酸序列中含有三个串联重复的C2H2型锌指结构域，属于C2H2型锌指蛋白家族的新成员。目前认为，C2H2型锌指蛋白的主要生物学功能是作为真核生物中普遍存在的核转录因子来调控基因的转录。其在细胞分裂与增殖、器官分化、胚胎发育、脂代谢调节等生命过程中起着十分重要的作用〔6〕。

本课题组在前期的研究工作中利用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库获得了与锌指蛋白ZNF580可能存在相互作用的多种蛋白，Smad2为其中之一。Smad2是转化生长因子-β(TGF-β)信号转导通路的关键分子。有文献显示：TGF-β是一类多功能的细胞因子，具有调节细胞外基质产生和沉积的强大作用，而细胞外基质的产生和沉积伴随着动脉粥样硬化发生、发展的进程。故TGF-β信号通路的活化可能与动脉粥样硬化的发生、发展密切相关〔7，8〕。研究显示：此信号通路的活化源于TGF-β与细胞表面的TGF-βⅡ、Ⅰ型受体的结合并形成配体-受体复合物，Ⅱ型受体通过磷酸化而激活Ⅰ型受体，Ⅰ型受体再磷酸化而激活细胞质内的Smads蛋白。Smad2属于受体激活型Smads蛋白，可与Ⅰ型受体直接作用并被磷酸化。活化的Smad2进入细胞核，通过与其他转录因子及调节蛋白形成稳定的蛋白-蛋白复合物而调控相应靶基因的转录〔9〕。

本研究应用不同浓度的TGF-β刺激内皮细胞，发现当TGF-β浓度从0.25～2 ng/ml逐渐增加时，ZNF580的表达呈逐渐下降趋势，但继续增加TGF-β刺激浓度至4 ng/ml，ZNF580的表达又有所回升。上述结果表明：ZNF580很可能是受TGF-β信号通路调控的核转录因子之一。其作用机制可能为：活化的Smad2转导进入细胞核，与ZNF580形成共作用因子，而使ZNF580的转录活性改变，二者共同发挥调节相应靶基因转录的功能，并进而参与调节血管内皮细胞增殖、凋亡等生物学行为，并可能在AS的发生发展过程中发挥作用。

4 参考文献

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8傅 华，刘小昔，杨 丽，等.TGF-β 对人血管内皮细胞整合素β3及粘着斑激酶表达的影响〔J〕.华西医大学报，2001；32(1)：21-3.

9杨 晓，黄培堂，黄翠芬.Smads 基因功能的研究进展〔J〕.Chin J Biochem Mol Biol,2000;1(16):145-50.