非小细胞肺癌中FADD蛋白的表达及与细胞凋亡蛋白P53的关系

段东奎 李 伟 苏鹏飞

(南阳市中心医院胸外科，河南 南阳 473009)

Fas相关死亡域蛋白(FADD)在许多正常和肿瘤组织中均能广泛表达，与组织表达异常或功能异常及肿瘤的发生、发展有密切的关系〔1〕。FADD主要作用通过与Fas胞浆区特异性结合中断细胞凋亡信息的转导过程〔2，3〕。而肿瘤抑制基因P53对肿瘤细胞的增殖分化起调控作用，P53在大多数肿瘤中均不表达，但在非小细胞肺癌(NSCLC)却异常表达。NSCLC中FADD的表达及与细胞凋亡蛋白P53是否存在关系，尚无定论。本文拟分析FADD蛋白及P53蛋白与NSCLC临床生物学的相关性。

1 资料与方法

1.1材料 标本取自2009年1月至2012年6月在我院住院经手术切除的肺癌患者61例，术前均未给予放疗或化疗治疗，男45例，女16例。年龄29～83〔平均(59.32±21.76)〕岁。经病理确诊：鳞癌37例，腺癌24例。根据TNM分期标准分为：ⅠA期0例，ⅠB期9例，ⅡA期12例，ⅡB期9例，ⅢA期12例，ⅢB期14例，Ⅳ期5例，局部淋巴结转移19例。距肺癌组织3 cm以上取30例癌旁正常组织作为对照组。所有标本均采用10%甲醛固定，同时用石蜡包埋。切片厚度为4 μm。

1.2主要试剂 兔抗人FADD多克隆抗体浓缩型，武汉博士德生物工程有限公司产品。小鼠抗人P53蛋白单克隆抗体，美国SIGMA公司产品。免疫组化染色试剂盒，北京中杉生物技术有限公司。

1.3免疫组化染色 石蜡切片脱蜡，加入0.3%H2O2甲醇，放置30 min后，采用5%山羊血清封闭背景染色。再次放置30 min后，切片加入兔抗人FADD多克隆抗体浓缩型及小鼠抗人P53蛋白单克隆抗体，比例为1∶50，同时放置于4℃的冰箱内6～8 h。室温37℃下，将比例为1∶100的羊抗兔和羊抗小鼠IgG加入至切片中。30 min后，切片加入比例为1∶100的链霉素核素-生物素复合物(SABC)。30 min后，进行DAB显色，根据显色程度终止反应。用自来水反复冲洗后，细胞核进行苏木精复染。脱水、封固后在显微镜下观察。

1.4结果判断 高倍镜下观察FADD及P53蛋白免疫组化染色。计算阳性细胞数占细胞总数(个数≥1 000)的百分比。FADD蛋白阳性反应主要为棕黄色颗粒位于细胞质或细胞膜上，P53蛋白阳性反应主要为棕黄色颗粒位于细胞核上。以阳性细胞比例≥10%为阳性，反之为阴性。

1.5统计学方法 应用SPSS17.0软件行χ2检验。

2 结 果

2.1FADD蛋白与P53蛋白测定结果 61例肺癌组织中FADD蛋白阳性率为88.52%(54/61)，30例癌旁正常组织中FADD蛋白阳性率96.67%(29/30)，两者比较差异无统计学意义(P>0.05)。61例肺癌组织中P53蛋白阳性率为75.41%(46/61)，明显高于30例癌旁组织(0.00%)(P<0.01)。

2.2FADD及P53蛋白表达与生物学指标的关系 见表1。FADD及P53蛋白的表达与NSCLC患者的年龄、性别、吸烟史、临床分型、病理类型、淋巴结转移、肿瘤直径等无明显的关系(P>0.05)，而与NSCLC的分化程度、TNM分期有关。

表1 FADD、P53蛋白表达与生物学指标之间的关系(n)

2.3FADD蛋白及P53蛋白表达的关系 61例肺癌组织中FADD蛋白及P53蛋白均表达异常仅45例，仅P53蛋白异常1例，仅FADD蛋白表达异常9例，两种蛋白均表达正常6例，表明FADD与P53蛋白表达相关，二着具有良好的一致性(χ2=12.56，P<0.01)。

3 讨 论

细胞癌变是一个复杂的生物学过程，与癌症因子和抑癌因子的状态密切相关〔4,5〕。大量的研究证实FADD蛋白在多种细胞受体介导的凋亡反应中起承上启下的重要作用，是传导过程中的重要衔接蛋白之一。但FADD蛋白在不同的癌症中表达不同，在大部分的癌症中FADD表达减少，而杨超等〔6〕研究发现FADD在NSCLC中呈高表达，本实验结果与之一致。其可能的原因：①在不同部位的细胞FADD的表达不一致。②细胞凋亡途径半胱氨酸蛋白酶(FADD-caspase)途径主要作用为通过传导和放大凋亡因子发出的信号来诱导靶细胞产生高效、快速的凋亡反应。凋亡分子肿瘤坏死因子相关凋亡有道配体受体(TRAILR)有两种，分别为死亡受体和诱捕受体。前一种的主要作用为直接导致细胞死亡，而后一种为抑制相关配体介导导致细胞死亡〔7〕。考虑到细胞凋亡是机体抗肿瘤的主要机制，NSCLC中FADD高表达是否与TRAILR相关，其机制如何，则有待进一步的研究。③NSCLC中FADD基因介导的凋亡反应不依赖Fas-FasL途径〔8〕。肺癌细胞中Fas抗体不能与FasL结合，从而导致细胞不能发生凋亡反应，造成Fas功能丧失。因此，即使肺癌细胞中Fas呈高表达状态，但FasL不能启动细胞的凋亡反应来杀灭肺癌细胞。本研究提示NSCLC恶性程度越高，FADD的表达水平越低〔9〕。而NSCLC的预后程度与临床分期的关系最为密切，因此，检测手术后肺癌组织的FADD表达水平，再结合临床分期和组织分化程度，可作为评估NSCLC预后情况的手段之一。

P53作为一种肿瘤抑制基因，其主要功能负责控制整个细胞周期的启动〔10，11〕。细胞是否进行分裂也由P53蛋白决定，P53基因在正常情况下主要负责监视和减慢细胞分裂过程。若细胞出现受损，又不能得到正常的修复，则P53蛋白将启动细胞凋亡反应，使这个细胞死亡〔12〕。故在正常的人体细胞中，P53蛋白含量低，免疫组化无法检测其含量。当正常细胞发生癌变时，P53基因失活，P53蛋白结构和功能发生改变，监视和减慢细胞分裂的能力逐渐被削弱，半衰期延长，在细胞内的稳定性增加，从而导致在细胞内的含量增加，故能被免疫组化法检测到〔13〕。所以，在免疫组化法检测受检细胞的P53蛋白表达阳性即表示细胞内的P53蛋白已经丧失抑癌作用。本研究结果提示了检测P53蛋白表达水平对肺癌确诊具有参考价值，但本研究阳性率未达到100%，提示在细胞癌变过程中，单一的癌基因激活并不是导致恶变的独立危险因素，而是多种基因突变共同造成的结果〔14〕。只是在不同时期的肿瘤中，往往由一种癌基因主导肿瘤的发展过程。本研究还表明NSCLC恶性程度越高，P53的表达水平越低。P53也能作为评估NSCLC预后情况的指标之一，FADD与P53表达具有良好的一致性。可作为评估NSCLC预后的手段之一。

4 参考文献

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