三种来源细胞因子诱导的杀伤细胞对人食管癌裸鼠原位移植肿瘤的转移抑制作用

姚文健 白 玉 赵宝生

(新乡医学院第一附属医院胸外科，河南 卫辉 453100)

我国食管癌5年生存率不足10%〔1〕。影响食管癌患者术后长期生存的主要问题是肿瘤的侵袭和转移〔2〕。因此，探索食管癌转移的抑制方法具有重要的研究意义。肿瘤的过继性免疫治疗是肿瘤治疗的一个全新领域〔3〕。细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞是一种新型、高效、广谱杀瘤的免疫活性细胞。输注CIK细胞的过继性免疫疗法已经成为手术、放疗、化疗后一种重要的辅助手段，它对于防止肿瘤的复发和转移具有重要的意义〔4〕。本文分析三种来源CIK细胞对人食管癌裸鼠原位移植瘤生长和转移的抑制作用。

1 材料与方法

1.1材料 脐血为新乡医学院第一附属医院妇产科提供，均系健康产妇正常分娩的脐带血；健康人外周血采自本院志愿者；食管癌患者的外周血由本院食管癌患者提供。BALB/C裸鼠由新乡医学院动物实验中心提供，3～4周龄，体重16～22 g，雌雄均可。裸鼠在恒温25～27℃、恒湿40%～50%、无特殊病原菌(SPF)级饲养室条件下饲养。

1.2试剂及仪器 基因重组人白细胞介素(rhIL)-2(上海华新生物高科技术有限公司)；基因重组人干扰素γ(rhIFN-γ)、CD3 单克隆抗体(McAb)(美国Cytolab公司)；基质金属蛋白酶(MMP)-9抗体(北京中杉金桥公司)；其他常用试剂及仪器由新乡医学院干细胞与再生医学研究中心提供。

1.3实验方法

1.3.1CIK细胞的制备 参照美国斯坦福大学CIK细胞培养方法〔5〕。外周血经血细胞分离机采集，经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞，按照细胞浓度2×106/ml混悬在无血清培养液中。CIK细胞的诱导：第0天向培养袋中以2 000 U/ml加入rhIFN-γ；置37℃、5%CO2孵箱中孵育。1 d后向培养袋中以1 000 U/ml加入rhIL-2；以50 ng/ml加入CD3MAb；置37℃、5%CO2孵箱中孵育。然后每2～3 d半量换液并补加细胞因子rhIL-2和CD3Mab。培养14 d，即获得CIK细胞。

1.3.2裸鼠原位移植模型的建立 选择低分化、淋巴结转移阳性食管癌组织，标本离体后在去除周围的纤维组织及坏死部分，用含有青霉素/链霉素双抗(终浓度为100 IU/ml)及10%胎牛血清的RPMI-1640培养液反复冲洗后，用弯剪剪成约1 mm3组织碎块。裸鼠经0.5%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射全麻。取2粒组织碎块包埋于裸鼠右腹部皮下继续饲养。成瘤后连续鼠间传代，取传3代后的瘤块作为裸小鼠的原位移植瘤块。裸鼠全麻后取腹正中线切口开腹，在手术显微镜下游离食管下段。做3 mm切口深达黏膜下层，经切口将2粒1 mm3瘤块以10/0无损伤缝合线固定于食管壁黏膜下层。以7/0丝线缝合腹膜，5/0丝线缝皮，继续饲养。

1.3.3动物实验 取32只原位移植术后荷瘤裸鼠，随机分为：食管癌患者自体外周血CIK细胞组、健康人外周血CIK细胞组、脐血CIK细胞组及生理盐水对照组，每组8只。移植后72 h经尾静脉给药，对照组注射生理盐水，各治疗组注射CIK细胞(2×1010/ml)，每天1次，每次0.3 ml，连续20 d。停药后72 h处死裸鼠。解剖测量瘤重，计算抑瘤率。抑瘤率=(1-治疗组平均移植瘤重/生理盐水对照组平均移植瘤重)×100%。观察淋巴结及内脏转移情况。

1.3.4免疫组织化学染色 采用免疫组化SP法，对各组肿瘤组织应用MMP-9抗体进行免疫组织化学染色。按阳性细胞占所观察细胞的百分率及着色强度综合计分行半定量分析。基本不着色者计为0分；着色淡黄色者计为1分；棕黄色者计为2分；棕褐色者计为3分。无阳性细胞计为0分，阳性细胞≤10%计为1分，阳性细胞11%～50%计为2分，阳性细胞51%～75%计为3分，阳性细胞>75%计为4分。染色强度与阳性细胞计分乘积0～2分记为(-)，3～5分为(+)，6～9分为()，10分～12分为()。

1.4统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行t检验和Fisher分析。

2 结 果

2.1各组移植瘤瘤重及抑瘤率 与对照组相比，CIK细胞治疗组的原位移植瘤重量明显减轻，且脐血CIK细胞组的瘤重明显低于另外二种来源的CIK细胞组(P<0.05)。而且其抑瘤率，明显高于健康人外周血CIK细胞组及食管癌患者自体外周血CIK细胞组(P<0.05)。见表1。

表1 三种来源CIK细胞对人食管癌裸鼠原位移植瘤的抑制作用(n=8，±s)

2.2各组移植瘤的远处转移情况 裸鼠解剖发现，对照组裸鼠食管肿瘤发生多发转移，转移多见于下段食管旁淋巴结、下肺韧带淋巴结、胃周淋巴结及肝、肺。与生理盐水对照组相比，CIK细胞治疗组的肿瘤转移明显被抑制(P<0.05)。脐血CIK细胞组的转移率明显低于另外二种来源的CIK细胞组(P<0.05)。见表2。

表2 各组裸小鼠移植肿瘤的远处转移情况(n，n=8)

2.3免疫组织化学染色检察 免疫组织化学染色可见对照组肿瘤组织中大量细胞MMP-9阳性表达；各治疗组肿瘤组织中MMP-9阳性细胞均明显减少(P<0.05)。见表3、图1。

表3 人食管癌裸鼠原位移植模型肿瘤组织中MMP-9的表达情况(n，n=8)

生理盐水对照组 脐血CIK细胞组

3 讨 论

中国是食管癌病死率最高的国家。一直以来，国内多采用食管癌术后辅助放、化疗的治疗方法，但这会引起消化道反应、抑制骨髓造血、降低患者免疫力等诸多不良反应〔6〕。现在许多学者开始积极探索生物治疗、基因靶向治疗等新途径。用免疫活性细胞输注的过继免疫疗法是肿瘤生物治疗的研究热点之一，此疗法不仅是常规抗肿瘤治疗的补充，更为晚期不宜手术或无法承受放疗、化疗不良反应的患者开辟了新的治疗途径〔7〕。CIK细胞是近年来发现的一种新型抗肿瘤细胞，其主要效应细胞表面既有T细胞的表面标志CD3，也有自然杀伤细胞的表面标志CD56，因而兼有T细胞的抗肿瘤活性和自然杀伤细胞的非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀伤肿瘤细胞的特点〔8〕。CIK细胞可由外周血及脐血的单个核细胞诱导培养而成，但目前对不同来源CIK的比较研究较少。本研究分别将食管癌患者自身外周血、健康人外周血、脐血三种来源的CIK细胞输注于荷瘤裸鼠，显示CIK细胞治疗组能明显抑制食管癌移植瘤的生长及转移，且脐血CIK细胞组抑制作用最强。

肿瘤侵袭和转移是一个多因素、多步骤的生物学过程。在肿瘤转移过程中，MMPs家族在促进肿瘤细胞迁移、细胞外基质降解和肿瘤远处转移等生物学行为中过程中发挥了关键作用，尤其是MMP-9被认为不仅可降解细胞外基质蛋白，还可调控血管内皮生长因子(VEGF)，与肿瘤新生血管形成相关，从而在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用〔9〕。已有研究指出，MMP-9的表达与食管癌的转移和侵袭有关〔10〕。而在本研究中，我们也观察到CIK细胞能下调裸鼠食管癌移植瘤中MMP-9的表达。因此，可以认为在CIK细胞抑制食管癌转移的过程中，抑制MMP-9的表达可能是其重要途径。

综上，CIK细胞具有一定的抑制肿瘤生长及转移的作用，其机制可能与降低肿瘤组织MMP-9表达有关。输注CIK细胞有望成为新的食管癌治疗方法。

4 参考文献

1蒋光耀.食管癌外科的治疗进展〔J〕.重庆医学，2004；33(2)：161-2.

2曹 峰，王 军，王 祎.食管癌术后辅助治疗研究现状〔J〕.中华放射肿瘤学杂志，2012；21(5)：483-6.

3曹世龙.肿瘤学新理论与新技术〔M〕.上海:上海科技教育出版社，1997：253- 360.

4肖永双，温儒民，郑俊年，等.IL-15联合CIK细胞治疗裸鼠肾癌移植瘤的实验研究〔J〕.中国肿瘤，2011；20(3)：231-5.

5Lu PH,Negrin RS.A novel population of expanded human CD3+CD56+cells derived from T cells with potent in vivo antitumor activity in mice with severe combined immunodeficiency〔J〕.J Immunol,1994;153(4):1687-96.

6蒋光耀.食管癌外科的治疗进展〔J〕.重庆医学，2004；33(2)：161-2.

7聂 鑫，刘侃峰，滕少侠.CIK治疗恶性肿瘤的研究进展及临床应用现状〔J〕.中国实用医药，2007；2(7)：106-7.

8张志凯，祁岩超.健康人和肿瘤患者CIK细胞的生物学特性〔J〕.中国热带医学，2009；9(2)：253-5.

9Bergers G,Brekken R,McMahon G,etal.Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis〔J〕.Nat Cell Biol,2000;2(10):737-44.

10郭 颖，王琳冬，郝秀轻，等.基质金属蛋白酶-2和-9在食管鳞状细胞癌中的过表达〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(3)：389-91.