S100A4在非小细胞肺癌中的表达及对肺癌A549细胞生物学行为的影响

杨 洋 樊玉霞 刘东雷 吴 恺 温丰标 赵 松

(郑州大学第一附属医院胸外科 河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南 郑州 450052)

非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总发病率的80%，起病隐袭，早期症状不典型，确诊时常已处于进展期，失去了最佳手术时机，5年生存率仅为15%〔1〕。肺癌预后较差不仅与早期诊断率低有关，更主要的是其较高的侵袭和转移能力。肿瘤的侵袭和转移需要细胞表面黏附相关分子的改变，此过程与肿瘤细胞的钙离子蛋白A4(S100A4)有着密不可分的关系〔2〕。本文通过观察S100A4对肺癌A549细胞增殖的影响，探讨S100A4与肺癌发生的关系和对治疗的指导意义。

1 资料和方法

1.1材料 收集2012年10月至2013年12月在郑州大学第一附属医院胸外科行外科手术切除的NSCLC标本及配对正常肺组织各67例。兔抗人S100A4多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology，S-P免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物科技有限公司，CCK-8试剂盒购自美国Sigma公司。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学 采用免疫组织化学S-P法，按照试剂盒说明操作。切片脱蜡、水化，经PBS漂洗后在3%过氧化氢溶液中孵育5～10 min。用抗原修复液修复抗原后加入山羊非免疫血清工作液封闭，滴加一抗工作液后4℃过夜，PBS漂洗后加入二抗工作液以及链酶卵白素工作液，二氨基联苯胺显色后苏木素复染细胞核。

1.2.2结果判断 由2位病理科医师在不知道患者临床资料的情况下，独立观察每张切片，每例切片在400倍镜下随机选取3个视野。首先根据染色强度(A)进行半定量计分：不染色为0分，轻度染色(淡黄色)为1分，重度染色(棕黄色)为2分，强染色(褐色)为3分；然后按照阳性细胞比例(B)评分：阳性细胞<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。免疫组织化学染色结果A×B，将结果分为0分，阴性(-)；1～4分，弱阳性(+)；5～8分，中度阳性()；9～12分，强阳性()。

1.2.3CCK-8法检测细胞活力 选对数生长期细胞，接种于96孔板，将不同浓度的重组人S100A4蛋白2、4、6、8、10 μg/ml分别与A549细胞在恒温孵箱中共同培养48 h。实验结束后向每孔加入10 μl CCK-8溶液继续孵育4 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度A值，计算生长抑制率(IR)=1-(A实验组/A对照组)×100%。

1.2.4细胞周期分析 取4 μg/ml 和6 μg/ml 重组人S100A4蛋白处理48 h后的A549细胞，0.2%胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心5 min，弃去上清；用PBS洗两遍，离心后弃去，加入70%冰乙醇固定30 min，4℃过夜；上机前，1 000 r/min离心5 min，弃去乙醇，PBS漂洗三遍；加入1 ml PBS制成细胞悬液，加RnaseA(终浓度50 μg/ml)，室温放置1 h；调整细胞浓度为1×106，加1 ml碘化吡啶(100 μg/ml)，避光30 min，最后通过流式细胞仪检测细胞周期。

2 结 果

2.1S100A4在NSCLC组织中的表达与临床资料、病理参数的关系 S100A4蛋白的阳性反应物质呈棕黄色或棕褐色，主要定位于胞质内，少量位于胞核或胞膜上。S100A4在癌组织中呈显著高表达(49/67，73.1%)，显著高于正常肺组织(9/67，13.4%)，且其在肺腺癌中的阳性表达率明显高于肺鳞癌和大细胞肺癌；伴淋巴结转移的NSCLC标本中的S100A4阳性表达率显著高于无淋巴结转移的标本，但S100A4阳性表达率与患者年龄、性别、肿瘤位置及分化程度无明显相关(P>0.05)。见图1，表1。

2.2S100A4蛋白对肺癌A549细胞生物学行为的影响 S100A4蛋白具有促进肺癌A549细胞增殖的作用，且呈浓度依赖性(图2)。同时，应用流式细胞术检测发现，与未加任何干预的A549细胞相比，4 μg/ml 和6 μg/ml 重组人S100A4蛋白处理48 h后的肺癌细胞，G0/G1期细胞百分比分别由78.24%下降至69.12%、58.79%，S期细胞百分比由14.75%上升至18.64%、24.03%，G2/M期由7.03%上升至13.24%、17.18%(P<0.05)。

A：肺腺癌，B：肺鳞癌，C：大细胞肺癌，D：正常肺上皮组织

图2 不同浓度重组人S100A4蛋白对肺癌A549细胞增殖能力的影响

表1 S100A4蛋白表达与临床病理因素的关系〔n(%)〕

3 讨 论

S100A4是钙结合蛋白家族的重要成员，具有EF双螺旋结构，主要通过改变细胞骨架结构参与细胞凋亡、增殖、细胞黏附、信号传导、细胞运动等多种生命活动，在肿瘤浸润转移中可能扮演重要角色〔3〕。近年来有多项研究发现S100A4在多种肿瘤细胞中存在过表达现象，与恶性肿瘤的发生、侵袭、转移和预后差密切相关〔4～6〕，提示S100A4很有可能是基因治疗肿瘤的一个有效靶点。

通过本文结果笔者推测S100A4蛋白可能作为致癌因子参与了NSCLC的发生、侵袭、转移的重要环节。S100A4蛋白处理的肺癌A549细胞增殖活力明显增强，且具有浓度依赖性推测S100A4蛋白在NSCLC组织中高表达，提高了肿瘤细胞的增殖活力，加速了肿瘤进展，但目前其分子机制尚有待进一步研究。S100A4可能成为抗肿瘤过程中的有效靶点，为肿瘤的基因治疗提供了新的方向。

4 参考文献

1童燕翔，洪志鹏.微创外科在肺癌综合治疗中的进展〔J〕.中华肺部疾病杂志，2013；6(1)：56-8.

2Bettum IJ，Vasiliauskaite K，Nygaard V，etal. Metastasis-associated protein S100A4 induces a network of inflammatory cytokines that activate stromal cells to acquire pro-tumorigenic properties 〔J〕. Cancer Lett，2014;344(1):28-39.

3Ramagopal UA，Dulyaninova NG，Varney KM，etal. Structure of the S100A4/myosin-IIA complex 〔J〕. BMC Struct Biol，2013;13:31.

4Liang J，Piao Y，Holmes L，etal. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4 〔J〕. Clin Cancer Res，2014; 20(1):187-98.

5Roh J，Knight S，Chung JY，etal. S100A4 expression is a prognostic indicator in small intestine adenocarcinoma 〔J〕.J Clin Pathol，2014; 67(3):216-21.

6Rasanen K，Sriswasdi S，Valiga A，etal. Comparative secretome analysis of epithelial and mesenchymal subpopulations of head and neck squamous cell carcinoma identifies S100A4 as a potential therapeutic target 〔J〕. Mol Cell Proteomics，2013; 12(12):3778-92.