甘肃甘南野生羊肚菌rDNA的ITS序列分析

王 龙，秦 鹏，王生荣，赵玉卉

(1.甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070； 2.甘肃省科学院 生物研究所， 甘肃 兰州 730000)

羊肚菌Morchellavspp.隶属于子囊菌亚门Ascomycotina、盘菌纲Discomycetes、盘菌目Pezizales、羊肚菌科Morchellaceae，是世界公认的一类珍稀食(药)用真菌。现有资料表明，各种羊肚菌相互间的宏观特征有着明显的差距，目前，不同学者对羊肚菌种的划分从3个种到32个种不等[1]。在我国西南各省、华东地区以及西北省份均已见到有关羊肚菌的种类分布、生态环境、资源调查与研究利用等方面的详实报道[2-6]。甘肃省甘南藏族自治区位于甘、青、川的过渡地带，地理位置N 33°20′～35°40′，E 100°52′～104°45′，海拔3 000～4 000 m，地势高崇，属高寒气候区[7]。该地区植被覆盖率高，生物群落稳定，其独特的气候特点造就了丰富的生物资源，也为羊肚菌的发生提供了优越的多样性生态条件。应用rDNA的ITS序列分析方法对在甘南地区采集、收集到的野生羊肚菌进行了分类鉴定，为深入研究该地区羊肚菌种类分化的变异规律提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

2011～2013年，以甘肃省甘南境内的森林山地、高原湿地和高寒草甸3种不同生态类型为重点进行当地野生羊肚菌真菌资源的采集与收集工作，先后共采集62株形态完好的野生羊肚菌子实体标本。参照卯晓岚主编《中国蕈菌》(2009年第1版)，根据收集到的羊肚菌子囊果的形状、颜色、大小及脉络特征等，同时参照网络数据库“Index Fungorum”中罗列的世界范围内羊肚菌的名称(包括种、亚种、变种及变型)，初步将其分类编号GN-M1、GN-M2、GN-M3、GN-M4、GN-M5、GN-M6和GN-M7。7个供试菌株子实体形态特征见图1。

1.2 基因组DNA的提取和ITS序列的扩增

取羊肚菌子实体的菌盖部分，用新型植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提取样品基因组DNA，并保存于4 ℃冰箱。采用White设计的ITS扩增通用引物ITS1和ITS4对供试材料的rDNA-ITS序列进行PCR扩增[8]。

ITS引物：上游引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3′

下游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′

(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。

图1供试羊肚菌子实体形态

Fig.1ThemorphologyofMorchellaspp.

PCR扩增反应体系为50μL，含:10×PCR buffer 5.0 μL；dNTPs 1.0 μL；模板DNA 1.0 μL；ITS1 1.0 μL；ITS2 1.0 μL；Taq聚合酶1.0 μL；双蒸水40.0 μL[9]。

PCR扩增程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性40 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸100 s，35个循环；72 ℃补平10 min，终止温度为4 ℃。采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测ITS-PCR扩增产物，用凝胶成像系统拍照记录电泳谱带。

1.3 ITS扩增产物的序列分析和系统树的构建

PCR扩增产物经电泳检测后，使用上海生工生物工程技术服务有限公司提供的UNIQ-10柱式 DNA胶回收试剂盒进行回收和纯化，并将样品送至上海生工进行测序。用DNAman对序列进行拼接，并对两端进行修剪。将序列在GenBank上进行BLAST分析，利用ClustalX 1.81进行同源性比较，MEGA 6.0绘制分子系统树[10]。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果及BLAST比对分析

PCR扩增出的目的片段条带单一清晰(图2)，GN-M1，GN-M2，GN-M3，GN-M4，GN-M5大小在1 000 bp～2 000 bp。序列经DNAman拼接后，大小均为1 200 bp，GN-M6和GN-M7的ITS序列在760 bp。将各供试样品的ITS序列提交GenBank数据库进行BLAST序列比对分析，结果显示，GN-M1、GN-M2、GN-M3与粗柄羊肚菌(GQ228465、AJ623265、GQ228446)序列的相似度达98%～99%；GN-M4、GN-M5与羊肚菌 (AM397272)序列的相似度达95%；GN-M6与黑脉羊肚菌(AJ544203)序列的相似度达99%；GN-M7与高羊肚菌(EF017946)序列的相似度达98%，且GN-M1、GN-M2、GN-M3和GN-M4、GN-M5的G+C含量>55%，GN-M6和GN-M7的G+C含量<55%(表1)。即BLAST比对的结果表明，7个供试羊肚菌子实体代表羊肚菌属中的4个种，分别为粗柄羊肚菌M.crassipes、羊肚菌M.esculenta、黑脉羊肚菌M.angusticeps和高羊肚菌M.elata。

图2 PCR扩增的ITS片段电泳检测图

注：图中1 GN-M1，2 GN-M2，3 GN-M3，4 GN-M4，5 GN-M5，6 GN-M6，7 GN-M7

2.2 基于ITS序列的系统树

把7个样品的ITS序列与GenBank中的尖顶羊肚菌M.conica(AM269501)、小海绵羊肚菌M.spongiola(DQ228476)、半开羊肚菌M.semilibera(AF008233)、高羊肚菌M.elata(EF017946)和红褐羊肚菌M.rufobrunnea(DQ355921)的 ITS序列进行比对，并用MP法构建分子系统树。从分子系统树可以看出(图3)，GN-M1、GN-M2、GN-M3和GN-M4和GN-M5与小海绵羊肚菌M.spongiola聚为第1类群，属于形态学分类中的黄羊肚菌类群(yellow morel)；GN-M6、GN-M7与高羊肚菌M.elata和尖顶羊肚菌M.conica聚为第2类群，属于形态学分类中的黑羊肚菌类群(black morel)，红褐羊肚菌和半开羊肚菌各自单独聚为一类。聚类结果表明，试验样品与这几种羊肚菌有一定的遗传距离，但样品彼此之间的遗传关系很近，粗柄羊肚菌和羊肚菌属于黄羊肚菌类群(yellow morel)，而黑脉羊肚菌和高羊肚菌属于黑羊肚菌类群(black morel)。

表1 羊肚菌ITS测序结果

图3 基于ITS序列的分子系统树(MP法，Bootstrap验证，重复1 000次)

3 讨论

rDNA的ITS区同时具有多变区和保守区，5.8S、18S和28S的序列在进化中趋于保守，种间变化小，而内转录间隔区ITS1和ITS2作为非编码区，最终不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速度快，种间差异大，且变异速度存在着较大的差异，适合种及种以下水平的分类研究[11]。以ITS区作为信号分子对甘肃甘南藏族自治州境内的野生羊肚菌进行了分子鉴定，发现7株供试羊肚菌菌株代表4个种，分别为粗柄羊肚菌、羊肚菌、黑脉羊肚菌和高羊肚菌，并归为黄羊肚菌类群(yellow morel)和黑羊肚菌类群(black morel)两大类。从分子系统树看来，供试羊肚菌之间ITS序列变异较大，可能是因为生长地的气候、海拔、植被等环境因素的不同导致羊肚菌的子实体有形态上的差别，对羊肚菌的系统进化产生了不同的影响，此种种内差异还有待收集更多的资料进一步研究。

参考文献:

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