人羊水特异蛋白质组学的探讨研究

朱斌 陈芳 侯常 黎丽红 黄素华

羊水对于胎儿的正常发育至关重要，其生成量和成分与胎儿的发育、胎盘和羊膜腔的功能密切相关[1］。羊水中蛋白质组学研究亦成为近年研究热点。本研究初步观察了在羊水中特异表达的蛋白质及高表达的蛋白质，旨在为妊娠相关疾病的发生、发病机制的探索研究提供理论依据，现报告如下。

材料与方法

一、试剂及仪器

1.试 剂

主要有：ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit血清高丰度蛋白去除试剂盒、四甲乙二胺（Sigma，美国），固相化pH 4～7、24 cm梯度干胶条、Bradford染液（Bio-Rad，美国），丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris、甘氨酸十二烷基磺酸钠（SDS）、尿素、CHAPs、过硫酸铵、碘乙酰氨、二硫苏糖醇（Amersham Pharmacia Biotech，瑞典），一氯乙腈（成都贝斯特）。

2.仪 器

包括：IPGphor3等电聚焦仪、EttanDALT垂直电泳槽、Image scanner扫描仪、超声仪（GE，美国），Autoflex speed？MALDI-TOF质谱仪（Bruker Dalton，美国），冷冻离心机（中国科学院武汉科学仪器厂）等。

二、蛋白样品的制备

选择3名正常妊娠晚期（37周）孕妇，征得其知情同意后，以羊膜穿刺法采集3份羊水标本，每份5 ml，同时以肘部穿刺取静脉血标本3份，每份5 ml。所采集的标本分别在4℃、16 000×g离心15 min，取上清，0.4μm过滤后分装， -70℃保存。离心超滤浓缩样品，ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit试剂盒去除血清高丰度蛋白质，加入4倍体积丙酮，-20℃沉淀过夜。沉淀所得到的蛋白于4℃、12 000×g离心20 min，弃上清，晾干，-80℃冻存备用。用Bradford法定量蛋白质浓度。

三、双向凝胶电泳及图像分析

将去除高丰度蛋白的蛋白团块重溶。24 cm干胶条在含100μg蛋白质样本和水化液的460μl混合液中20℃水化10～12 h。将胶条放入等电聚焦盘中加电压聚焦。第一向等电聚焦电泳 （IEF）后，待胶条平衡，再进行12%的聚丙烯电泳酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，电泳所得的双向凝胶用双胺硝酸银法染色及考马斯亮蓝染色，Imagescanner扫描仪进行透射扫描，获得的数字化图像运用ImageMaster 2D platinum 5.0软件进行蛋白质点的检测、量化、背景扣除、点的匹配。着重选择pH4～7，分子量10～55 KDa区域进行观察，从羊水中找到仅在羊水中表达的蛋白质点及在羊水中表达量高于血清2倍以上的蛋白质点，随机选取重复性和分辨率较高的10个差异蛋白质点行基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱 （MALDI-TOF/TOFMS）鉴定。

四、MALDI-TOF/TOF-MS分析

选取行MALDI-TOF/TOF-MS分析的蛋白质点后行挖点、脱色、还原、烷基化、酶解、样品回收及脱盐处理、肽段提取后点靶上机，使用Autoflex speedTMMALDI-TOF-TOF质谱仪进行质谱分析。利用flexAnalysis软件过滤基线峰、识别信号峰。利用Mascot软件搜索NCBI及Uniprot数据库，寻找匹配的相关蛋白质，同时查询其功能，明确鉴定的蛋白质为何种蛋白质。

结 果

一、高丰度蛋白去除后双向凝胶电泳分析结果

在pH 4～7、分子量10～55 KDa的区域中，羊水及血清的蛋白质位点分布大部分相同，血清组的斑点多于羊水组（见图1A、B）。经ImageMaster 2D platinum 5.0软件分析，羊水中约有（613±29）个蛋白质点，血清中约有（785±64）个蛋白质点，羊水中特异表达的蛋白点约50个（见图1C），羊水中表达量高的蛋白点约50个（见图1D）。

图1 去除高丰度蛋白后的双向凝胶电泳分析结果

二、MALDI-TOF/TOF-MS分析结果

随机选取重复性和分辨率较高的10个浓度差异的蛋白质斑点行质谱分析鉴定，质谱分析结果见图2及表1。

讨 论

羊水作为胎儿生长发育最为重要的因素之一，在多种妊娠疾病的发生中有重要作用。蛋白质组学是继人类基因组计划完成后的新兴学科[2］。随着人类蛋白质组学组织（HUPO）的正式成立，蛋白质组学蓬勃发展，渗透到各个学科。近年来，国内外均有学者对妊娠妇女血液、羊水进行了蛋白质组学的研究，探索新的妊娠蛋白和疾病特异蛋白，以及蛋白质在妊娠相关疾病发生、发展中的相互作用。然而，目前的多数研究集中于寻找羊水中特异性的差异蛋白，笔者前期经nano LC/MS/MS对羊水的蛋白组学分析，已经发现羊水中人62种特异性蛋白[3］。本次通过比较Anderson等[4］和Michel等[5］的结果，新检测到了22种仅在AF中表达的蛋白，其中14种是分泌型蛋白，其余8种分布于细胞膜、细胞质和细胞核。羊水特异性蛋白斑点约50余个，与此前nano LC/MS/MS的结果相符，故本研究不行此类斑点的质谱分析。

图2 3种在羊水和血清中呈浓度差异表达的蛋白质

表1 10个在羊水及血清中呈浓度差异表达的蛋白质斑点质谱分析结果

本研究初步探讨在羊水和血清中均有表达，但羊水中表达量明显要高于血清的一些蛋白质。研究初步挑选其中10个重复性和分辨率较高斑点行质谱鉴定，检索UniProt等在线蛋白数据库，除2个斑点为细胞膜及细胞质蛋白外，余均为分泌型蛋白质。这些蛋白的已知功能如下：硫酸类肝素蛋白多糖（HSPG2）是基底膜的主要成分，对心脏发育及血管调节起着重要作用，此类蛋白质缺乏可导致常染色体隐性遗传病侏儒综合征的发生[6］。绒毛膜生成激素（CSH1）具有刺激泌乳、促进胎儿生长及新陈代谢等作用[7］。载脂蛋白AI为双超螺旋模型的溶液结构B链，参与胆固醇的转运，使其从组织中转运至肝脏。因其影响胆固醇代谢，在HDL缺乏症及淀粉样变中起着重要的作用，其缺乏可引起早发冠心病，肝、脾肿大，复发性周围神经病变，进行性肌肉萎缩和无力，其突变可致淀粉样多神经病肾病、家族性淀粉样多神经病[8-9］。AMBP蛋白是α1微球蛋白前体，具有抑制胰蛋白酶、纤溶酶、粒细胞前溶酶体酶及草酸钙结晶的作用[10］。另外，胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）具有延长胰岛素样生长因子的半衰期，调节IGF的促进生长作用[11］。载脂蛋白E与胎儿生长有一定关系[8］。硫氧还原蛋白过氧化物酶2（PRDX2），与细胞氧化还原调节有关，在清除新陈代谢过程中产生的过氧化物起着重要的作用，通过调节细胞内过氧化氢的浓度，诱使生长因子和TNF-α的信息传导[12］。BPIFA1蛋白与接触刺激物后引起的气道炎症有一定的关联，与上呼吸道的天然免疫有一定关系。亦在肿瘤的演化进展起着一定的作用[13］。补体因子B是补体系统的替代途径，被D因子激活成2个片段Ba、Bb，Bb结合3b因子产生C3或C5转化酶，对B细胞的增殖及分化起着一定作用，Ba的作用与此相反，与溶血性尿毒综合征非典型4（AHUS4）有关[14］。羊水的某些蛋白质表达可反映妊娠生理或病理状态，可能有助于妊娠相关疾病如胎儿宫内生长受限、子痫前期、早产、宫内感染甚至羊水栓塞等的早期诊断。本研究中在羊水表达水平偏高的蛋白质是否可提供某种诊断依据还待进一步研究证明。此外，鉴于本研究仅采用质谱蛋白鉴定策略，今后将对羊水中呈差异表达的蛋白质采用免疫印迹或其他的方法行进一步验证，以确定其是完整的蛋白还是片段蛋白。

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