东南亚青年人群中马拉色菌菌种构成分析

张浩 熊心猜 冉玉平 刘婷 陈玉娟

(1.川北医学院附属医院皮肤科，南充 637000;2.四川大学华西医院皮肤科，成都 610041)

嗜脂性酵母马拉色菌属 (Malasseziaspp.)是人类及动物皮肤表面常驻菌群，几乎在所有成人皮肤上都可以培养出来。作为一种条件致病菌，根据其rRNA基因序列，马拉色菌属的分类现已扩增至13个菌种，包括10个亲人性嗜脂菌种:糠秕马拉色 菌 (M.furfur)，合 轴 马 拉 色 菌 (M.sympodialis)，球形马拉色菌 (M.globosa)，斯洛菲马拉色菌(M.slooffiae)，钝形马拉色菌(M.obtusa)，限制马拉色菌 (M.restricta)，日本马拉色菌 (M.japonica)，皮 肤 马 拉 色 菌 (M.dermatis)，大和马拉色菌 (M.yamatoensis)和娜拉马拉色菌(M.nana)，以及3个亲动物性菌种:厚皮马拉色菌 (M.pachydermatis)，羊马拉色菌(M.caprae)和马马拉色菌 (M.equina)［1-10］。我们对来源于东南亚部分国家青年人群的马拉色菌菌种进行菌种鉴定，分析其构成情况。

1 材料与方法

1.1 标本来源

标本采集于2011年和2012年秋季来我校留学的尼泊尔、巴基斯坦、印度青年留学生以及当年入学的中国大学新生，共285例。其中男168例，女117例，年龄18～26岁，平均20岁。在志愿者到校报到的1～2 d内予以标本采集。

1.2 标本采集和培养

签署知情同意书后，使用TregadermaTM无菌透明敷贴 (3 cm×7 cm)，采集正常志愿者皮脂溢出丰富区(额头、左右面颊)或相关疾病 (花斑糠疹、脂溢性皮炎、痤疮，均临床诊断明确)患者皮损区鳞屑标本［11］。将敷贴置于Leeming＆Notman培养基(葡萄糖5 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏0.1 g，牛胆盐4 g，甘油 1 mL，单硬脂酸甘油酯 0.5 g，0.5 mL 吐温60，1%10 mL 全脂牛奶，2% 橄榄油，琼脂 14 g，0.05%氯霉素，0.05%放线菌酮，加蒸馏水至1 000 mL)中，32℃培养7～10 d，待菌落生长后挑取菌落进行划线接种和分离培养。

1.3 标准菌株

选用目前人所携带的10种马拉色菌标准株，分别为糠秕马拉色菌 (M.furfurCBS1878)、合轴马拉色菌 (M.sympodialisCBS7222)、厚皮马拉色菌 (M.pachydermatisCBS1879)、限制马拉色菌(M.restrictaCBS7877)、球 形 马 拉 色 菌 (M.globosaCBS7966)、钝形 马拉 色 菌 (M.obtusaCBS7876)、斯 洛 菲 马 拉 色 菌 (M.slooffiaeCBS7956)，大 和 马 拉 色 菌 (M.yamatoensisM9985)、日本马拉色菌 (M.japonicaM9966)、皮肤马拉色菌 (M.dermatisM9927)。日本Sugita教授和韩国Ahn教授惠赠。

1.4 主要试剂

过氧化氢、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、氯霉素、放线菌酮 (Sigma Co.Ltd.，USA)，其余生化试剂购于常州新华活性材料研究所。

1.5 生化和形态学鉴定

我们根据既往的国外文献报道［3，5-8，10，12-14］，总结了目前所有马拉色菌属各菌种的表型特征 (见表1)，并据之进行脂质依赖试验、温度生长试验、吐温生长试验、蓖麻油试验、过氧化氢产气试验、β-葡萄糖苷酶试验等鉴定菌种。

表1 马拉色菌属13个种的表型特征Tab.1 Phenotypic characteristics of all Malassezia species

1.6 质量控制

以标准株作为对照。所有标本在划线分离后均分为3份，1份于-70℃下备份，另两份由两人独立操作，分别进行菌种鉴定并将结果相互印证，对结果出现差异的菌株，再次互相鉴定确认，直至结果相互吻合。

2 结 果

2.1 一般资料

本次共收集了4个不同国家青少年人群 (中国185例;巴基斯坦32例;印度38例;尼泊尔30例)中马拉色菌标本，共分离出501株马拉色菌菌株。志愿者的基本资料见表2。

2.2 菌种鉴定

分离出的501株马拉色菌属中，鉴定出8个菌种，以球形马拉色菌为主，共计203株，占40.5%(203/501)。其次依次为合轴马拉色菌19.0%(95/501)、糠秕马拉色菌 16.0%(80/501)、限制马拉色菌11.0%(55/501)、斯洛菲马拉色菌6.2%(31/501)等。各菌种分布情况见表3。

表2 临床志愿者基本情况Tab.2 Information of clinical volunteers

表3 来源于四个东南亚国家人群的马拉色菌属菌种鉴定情况(株)Tab.3 Identification results of Malassezia species from 285 volunteers from four countries in Southeast Asia(strain)

3 讨 论

对于马拉色菌在人正常皮肤及各相关性疾病中的菌种分布，国内外有很多培养鉴定报道，结果有的相似，也有的存在较大差异，如有报道正常皮肤菌群以糠秕、合轴马拉色菌为主的，也有报道以球形马拉色菌为主，在相关性疾病如花斑糠疹中，有报道以合轴马拉色菌为主，也有报道以球形马拉色菌为主。这些差异原因多被认为与地理环境有关［15-17］。但目前尚缺少一个全球性的马拉色菌流行病学调查资料来证实这个观点，而且目前的分子学技术应用表明这些差异的原因很可能和常规的培养鉴定方法本身也有关系。

随着分子生物学技术的发展，越来越多的分子学方法用于马拉色菌菌种的鉴定。其中，不依赖培养的DNA直接提取鉴定法在马拉色菌菌种鉴定及流行病学调查中展现其快速、准确的优点。常用的鉴定方法是将培养基上培养出的菌落再行分离鉴定，其本身存在一定缺陷如结果判断的主观误差、费时、容易污染等。马拉色菌做为嗜脂性酵母，对培养的营养要求高，加之不同菌种的生长活性差异很大，容易造成培养中的假阴性，也不适用于全球流行病学调查及不同实验室之间的数据共享及交流。我们首次在国内应用非培养法对脂溢性皮炎患者马拉色菌菌种构成进行了鉴定［11］，其结果与循证统计［18］和国外脂溢性皮炎人群的马拉色菌菌种构成报道［19-21］相似，都以球形和限制马拉色菌为主。但非培养法鉴定不能分离出活体菌种，不能保存实体菌种以及用于后续的表型研究等，所以常规培养鉴定仍是非常重要、不可或缺的方法。

本研究在国内首次对目前所有马拉色菌菌种的生理生化鉴定特性进行了总结，并首次对东南亚部分国家青少年健康人群及马拉色菌相关疾病患者的马拉色菌菌种进行培养鉴定分析。为了尽量降低上述的常规培养鉴定法误差，我们以标准株作为对照，并以两人独立操作进行质量控制。其结果表明，来自四个东南亚国家青少年人群的马拉色菌属均以球形马拉色菌为主，且无论是健康志愿者还是相关疾病患者，球形马拉色菌均为主要菌种，且与患者的性别也没有关系，这与我们以及国外进行的非培养马拉色菌菌种鉴定结果一致［11，19-21］。在本实验纳入的四个东南亚国家中，优势菌种都为球形马拉色菌、合轴马拉色菌和糠秕马拉色菌，并未见明显的地理学差异，提示既往不同的培养鉴定研究报道的结果差异可能与培养方法本身有一定关系，故要求采取培养后表型鉴定法时一定要严格按方法进行操作，并最好两人以上独立操作后对照比较，以降低主观误差和假阴性率。当然，由于条件所限，本实验纳入的东南亚国家数以及相关人数均较少，结果具有一定提示意义，需要后续更大样本量的研究来进一步证实。

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