血浆同型半胱胺酸水平和5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与原发性下肢深静脉血栓形成的相关性研究

郑永红，陈群，朱德晓，张世袍

血浆同型半胱胺酸水平和5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与原发性下肢深静脉血栓形成的相关性研究

郑永红，陈群，朱德晓，张世袍

目的：探讨血浆同型半胱氨酸（Hcy）水平及5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因多态性与原发性下肢深静脉血栓形成的关系。

方法:选择原发性下肢深静脉血栓患者220例（病例组）和同期对照者240例（对照组），收集年龄、性别和体重等临床资料，测定空腹血糖、血清总胆固醇、纤维蛋白原和D二聚体等生化指标，采用酶联免疫吸附法测定血浆Hcy水平，并应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法进行MTHFR C677T基因多态性的分析。两组年龄、性别、体质指数、空腹血糖和血清总胆固醇差异均无统计学意义（P＞0.05），病例组纤维蛋白原、D-二聚体和血浆Hcy值高于对照组（P＜0.05）。

结果: MTHFR TT 基因型在病例组的分布频率为16.8%高于对照组6.7%，差异有统计学意义（P＜0.05）。病例组CT基因型、TT基因型与CC 基因型相比血浆Hcy 水平均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；而在对照组中只有TT基因型与高于CC 基因型，差异有统计学意义（P＜0.05）。无论是CC基因型、CT基因型或TT基因型，病例组的血浆 Hcy 水平均高于对照组（P＜0.05）。

结论:血浆高Hcy水平是原发性下肢深静脉血栓形成的危险因素。MTHFR C677T基因多态性中TT 基因型可能是原发性下肢深静脉血栓形成的一个重要风险遗传因子。

下肢深静脉血栓形成；同型半胱胺酸；5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:209.)

同型半胱氨酸( Hcy )是一种含巯基的氨基酸,是蛋氨酸的中间代谢产物。在Hcy代谢过程中，5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是其代谢途径中的关键酶，MTHFR 基因第677位C→T 突变（MTHFR C677T）可以导致血浆Hcy的水平改变[1]。近来研究表明，高同型半胱氨酸血症是中国人的心血管疾病的独立危险因素[2、3]。MTHFR 基因多态性也与心脑血管[4]和外周血管疾病[5]密切相关，但MTHFR基因是否完全通过影响Hcy的水平起作用至今机制未明[6]。大多数学者认为轻、中度升高的血浆同型半胱氨酸水平与深静脉血栓成正相关。然而对于MTHFR基因多态性与静脉血栓的关系，国内外文献报道结论不一。目前国内对于原发性深静脉血栓与Hcy及MTHFR C677T 基因相关性的系统研究尚少。本研究目的旨在探讨血浆Hcy水平及MTHFR C677T 基因多态性与中国南方汉族人原发性下肢深静脉血栓的关系，进一步了解原发性深静脉血栓形成的主要危险因素。

1 资料与方法

实验对象：病例组：2008-07至2012-06因原发性下肢深静脉血栓入住福建省立医院的患者220例，其中男114例，女106例，年龄42～78岁，平均(67±13)岁，均为福建汉族人。纳入标准：根据2008年中华医学会血管外科分会制定的深静脉血栓诊治指南，并且经下肢深静脉血管造影检查证实静脉血栓存在，排除严重心脑血管及肝肾疾病、恶性肿瘤、骨折、近期手术、妊娠、长期激素治疗等继发性因素所致的血栓形成，以及近一周内应用抗凝药及其他部位血栓病史者。对照组：选取同期在我院体检中心年龄、性别和体重构成相匹配的健康体检者240例，其中男127例，女113例，年龄40～76岁，平均(66±15)岁。测定病例组及对照组体质指数、空腹血胆固醇、空腹血糖、纤维蛋白原及D二聚体，并采用酶联免疫吸附法（ELISA）于酶联仪测定血浆Hcy 水平（Hcy试剂盒购自浙江大学生科生物技术有限公司）[7]。两组研究对象在年龄、性别构成、体质指数、血胆固醇和空腹血糖值上差异均无统计学意义，血纤维蛋白原、D-二聚体和血浆Hcy值在病例组显著高于对照组（P＜0.05）。（表1）

表1 两组基本临床资料比较（±s）

表1 两组基本临床资料比较（±s）

注：与对照组比较 *P＜0.05

项目 对照组(n=240) 病例组(n=220)年龄 (岁) 65.6±15.3 67.3±12.6性别(男/女 ) 127/113 114/106体质指数 (kg/m2) 21.8±3.6 23.1±3.8空腹血胆固醇 (mmol/L) 4.89±0.8 4.72±1.1空腹血糖 (mmol/L) 4.85±0.8 5.04±0.9纤维蛋白原 (mmol/L) 3.24±0.9 3.76±1.4 *D-二聚体(mmol/L) 0.35±0.3 15.5±0.7 *同型半胱胺酸 (μ mol/L) 10.15±4.6 14.98±7.0*

基因型检测：脱氧核糖核酸（DNA）提取试剂盒提取各组外周静脉血白细胞DNA，并用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCRRFLP)法检测基因型。MTHFR基因型上游引物：5’-GTGTGGGAGCTTGGAGCAAT-3’,下游引物：5’-GAAAAGCTGCGTGATGATGA-3’。 聚 合 酶 链反应反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共38个循环，最后72℃延伸8 min。取PCR产物，3%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪成像，并经基因测序明确基因型。

统计学处理：所有数据均用SPSS 15.0软件进行统计分析。用直接计数法计算各组病例和对照组的性别、基因型及等位基因频率。组间基因型及等位基因频率用卡方检验。均数组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

基因多态性分析：MTHFR基因的聚合酶链反应产物为369 bp，可被酶切产生193 bp、112 bp、64 bp三个片段。位于第677位碱基存在C-T突变，当第677位碱基突变为T时，193 bp片段可进一步被酶切成165 bp和28 bp。28 bp太小，易跑出琼脂糖。故存在193 bp、112 bp、64 bp条带为CC型，存在165 bp、112 bp、64 bp条带则为TT型，193 bp、165 bp、112 bp、64 bp四个条带同时存在则为CT型（图1）。两组人群基因型分布经卡方检验均符合Hardy-Weinberg平衡，因此具有人群代表性。MTHFR TT 基因型在病例组的分布频率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。TT 基因型与下肢深静脉血栓显著相关（比值比：2.77，P＜0.05）。

表2 两组不同5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因型分布频率比较 [例（%）]

不同 MTHFR 基因型血浆Hcy 水平的比较 ：无论是CC基因型、CT基因型或TT基因型，病例组的血浆Hcy 水平均高于对照组（P＜0.05）。病例组CT基因型、TT基因型与本组CC 基因型相比血浆Hcy水平均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；而在对照组中只有TT基因型与高于本组CC 基因型，差异有统计学意义（P＜0.05）。（表 3）

表3 两组不同5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因型血浆同型半胱氨酸水平比较 （μ mol/L±s)

表3 两组不同5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因型血浆同型半胱氨酸水平比较 （μ mol/L±s)

注：与对照组比较 *P＜0.05；与本组CC基因型比较 △P＜0.05。余注见表2

MTHFR基因型 对照组(n=240) 病例组(n=220)CC 9.08±4.7 12.08±6.9*CT 11.31±4.5 17.16±7.6*△TT 14.15±3.5△ 19.02±5.3 *△

3 讨论

下肢深静脉血栓形成是一种发病率很高的周围血管疾病，近年来在我国有一个较快上升的势头。原发性深静脉血栓形成是排除继发因素的原发性血栓性疾病，主要与遗传和环境相关。Hcy可导致血管内皮损伤、血栓形成，是血液高凝状态形成的重要原因之一。Gatt等[8]认为高Hcy是静脉血栓性疾病的独立危险因素。本组研究结果显示，病例组Hcy 水平明显高于对照组，证实了Hcy与原发性深静脉血栓形成关系密切，高Hcy是原发性血栓性疾病的一个重要的危险因子。

血中Hcy水平升高主要受遗传和营养因素的影响。研究发现MTHFR基因的突变是引起Hcy改变的主要遗传因素，两者之间存在正相关关系[9]，它的多态性可以通过影响酶的活性而影响血浆Hcy水平。另有学者认为它也可通过MTHFR酶直接影响内皮的功能，从而是心血管疾病的独立的影响因子，而不依赖于高Hcy产生效用[6]。目前国内外关于MTHFR基因多态性与静脉血栓栓塞症的相关性文献报道结论不一，甚至相反。于海东等[10]和Yin等[11]报道MTHFR的TT基因型在静脉血栓组的分布频率高于对照组, MTHFR C677T多态性中TT基因型可能是深静脉血栓形成的一个遗传风险因子。但有些学者认为MTHFR基因C677T突变并不是静脉血栓栓塞症的独立危险因子[12、13]。造成结论不一的原因，考虑可能与MTHFR C677T的种族、地域分布差异有关，也可能与样本量及实验设计有关。我们研究发现TT基因型在原发性深静脉血栓的分布频率高于对照组。进一步研究表明，中国南方汉族人中，无论是CC 基因型、CT 基因型或TT 基因型，病例组的Hcy水平均明显高于对照组，提示了高Hcy血症可能是导致下肢深静脉血栓发病的重要因素之一。在病例组中CT 基因型与CC 基因型相比、TT 基因型与CC基因型相比Hcy 水平均升高，差异有显著意义，而在对照组中只有TT 基因型与CC 基因型相比较差异有统计学意义，这提示TT 基因型突变与高Hcy血症有着密切关系。目前国内外更多的研究静脉血栓栓塞症与上述两者的关系中包含许多继发性因素如：骨折手术与制动、瘫痪或长期卧床、长期使用雌激素、恶性肿瘤、妊娠、口服避孕药和心脑血管及肝肾疾病等，都对研究造成一定影响。而我们的研究选择的人群为单纯的原发性下肢深静脉血栓的患者，且均经下肢静脉造影明确诊断，排除了许多继发性的因素的干扰，同时校正了高胆固醇和高血糖两个可能影响结果的因素。我们推测，MTHFR基因通过第677位C→T突变引起血浆Hcy水平增高，从而参与下肢深静脉血栓的发病过程，我们认为MTHFR TT基因型突变可能是引起下肢深静脉血栓患者高Hcy 血症的重要遗传因素，这与凯丽比努尔[14]的看法一致，即TT基因型仍然主要通过影响Hcy的水平来影响血栓的形成。而与凯丽比努尔看法不同之处在于我们认为MTHFR基因C677T多态性可能是下肢深静脉血栓形成的一个独立的重要的遗传风险因子。

原发性下肢深静脉血栓发病是多因素参与的病理过程，也许将来可以通过筛查MTHFR 基因来预测部分人群的静脉血栓形成。当然目前尚待大规模的临床数据来证实这一方法的可行性。由此通过提高这类疾病的诊治水平，从而改善其预后。

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Relationship Between Homocysteine Level, 5, 10-Methylenetetrahydrofolate Reductase Gene Polymorphism With Primary Lower Extremity Deep Venous Thrombosis Formation

ZHENG Yong-hong, CHEN Qun, ZHU De-xiao, ZHANG Shi-pao.
Department of Cardiology, Fujian Provincial Hospital, Fuzhou (350001), Fujian, China

ZHENG Yong-hong, Email: zhengyongh@21cn.com

Objective: To explore the relationship between homocysteine (Hcy) level, 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR) gene polymorphism with primary lower extremity deep venous thrombosis (LEDVT) formation.

Methods: Our research included 2 groups, LEDVT group, n=220 patients and Control group, n=240 healthy subjects with the matched age, gender and body weight. The fasting blood glucose (GLU), total cholesterol (TC), fi brinogen (Fng)and D-dimer were determined, plasma Hcy level was measured by ELISA, MTHFR polymorphisms were detected by PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) in both groups.

Results: The age, gender, BMI, GLU and TC levels were similar between 2 groups, P>0.05 and the Fng, D-dimer and Hcy levels were higher in LEDVT group than those in Control group, P<0.05. The distribution frequency of MTHFR TT genotype was higher in LEDVT group than Control group, 16.8% vs 6.7%, P<0.05. The patients with genotypes of CT, TT and CC in LEDVT group had the higher Hcy level than those in Control group, P<0.05. While in Control group,the TT genotype had the higher Hcy level than that in CC genotype, P<0.05.

Conclusion: Increased plasma Hcy level was the risk factor for LEDVT formation and the TT polymorphism of MTHFR might be one of the important genetic risk factors.

book=3,ebook=91

Lower extremity deep venous thrombosis formation; Homocysteine; 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase

350001 福建省福州市，福建省立医院 心血管内科(郑永红、陈群）；泉州市一医院 心血管内科（朱德晓）； 三明市第二医院 心血管内科（张世袍）

郑永红 副主任医师 硕士 主要从事心血管疾病的临床诊断治疗和研究 Email: zhengyongh@21cn.com 通讯作者：郑永红

R54

A

1000-3614（2014）03-0209-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.03.013

2013-10-25）

（编辑：王宝茹）